bv2小鼠小胶质细胞株gpr17基因稳定转染及其功能鉴定

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1、浙江大学硕士学位论文BV2小鼠小胶质细胞株GPR17基因稳定转染及其功能鉴定姓名：王欣欣申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：魏尔清201201浙江大学硕士学位论文中文摘要BV2小鼠小胶质细胞株GPRl7基因稳定转染及其功能鉴定浙江大学医学院药理学2009级硕士研究生王欣欣导师魏尔清教授中文摘要研究背景：小胶质细胞是脑内的免疫、炎症相关细胞．“静息态”小胶质细胞缺乏吞噬功能，但在病理条件(如脑缺血后继发性炎症以及退行性脑变性疾病)时，则变形为阿米巴样，可以吞噬死亡细胞，清除细胞残骸，参与调节组织修复、放大炎症反应、神经元变性等，对包括嘌呤、嘧啶类似物、补体、细胞因

2、子和趋化因子等物质均有反应。花生四烯酸经5-脂氧酶(5-1ipoXygen弱e)代谢产生半胱氨酰白三烯(cysteinylleul【otrienes，Cysu’s，包括L1℃4、u’D4和L17E4)是一类重要的炎症介质。脑缺血以及脊髓外伤后均有半胱氨酰白三烯类物质释放，通过激活其受体产生多种效应．半胱氨酰白三烯受体有cysLTl和CysLT2受体两种经典的亚型．近来报道GPRl7(Gp∞tein-coupledreceptor17)是一种尿嘧啶核苷酸／半胱氨酰白三烯双重受体，能被尿嘧啶核苷酸类物质∞DP'UDP-glucose和uDP．galaCtose)和Cys

3、Llls激活。目前，GPRl7的研究较少，因此，构建稳定转染GPRl7真核表达质粒的细胞株，可为研究其功能奠定基础．GPRl7在容易遭受缺血性损伤的器官(即脑、心和肾)呈高表达，在应激或者¨浙江大学硕士学位论文中文摘要病理条件下起重要的调节作用。正常脑内，GPRl7主要表达在神经元以及少突胶质细胞前体细胞上，在星形胶质细胞上没有表达。大鼠局灶性脑缺血后，GPRl7主要表达在激活的小胶质细胞，并且缺血中心区GPRl7mRNA和蛋白的表达在12．24h和7．14d呈现两个高峰，在周边区只在7．14d时有表达上调。小胶质细胞除了表达GPRl7和半胱氨酰白三烯受体之外，还表

4、达其他核苷酸P2受体。GPRl7作为一种新型半胱氨酰白三烯／尿嘧啶核苷酸双重受体，负调控CysLTI受体的作用已得到阐述，但在小胶质细胞上有无这种作用还不明确，因此，需要在小胶质细胞进行研究。目的：建立稳定转染mGPRl7的BV2细胞，并在此基础上研究mGPRl7激活后对BV2细胞吞噬功能的影响。方法：采用脂质体转染的方法将pcDNA3．1-mGPRl7转到BV2细胞中，并用350p∥mlG418筛选得到阳性单克隆细胞株。ImPcR、免疫荧光法以及westemblotting方法检测mGPRl7表达，Fluo-4测定激动剂UDP或者吼处理后细胞内钙变化，．免疫荧光计

5、数法或者流式细胞术，检测给予CysLTl受体拮抗剂p砌ukaSt或siI矾A敲低GPRl7后，对激动剂UDP、LTD4诱导BV2细胞吞噬功能的作用。结果：RT．PCR、免疫荧光法以及wrestemblotting结果表明，重组的真核表达载体pcDNA3．1(+)．mGPRl7在BV2细胞获得表达。加入外源性激动剂UDP或uD4后，3种BV2细胞(BV2．wT细胞、BV2．pcDNA3．1细胞、BV2．mGPRl7细胞)的荧光强度比值阶o(F代表给予激动剂之后120s内的最大荧光强度值，Fo代表给予激动剂之前各个时间点的平均荧光强度值)没有显著性差异，但是，UDP诱导

6、BV2．mGPRl7细胞的反应性细胞数显著增加，曲线下面积显著增加，BV2-pcDNA3．1细胞的反应性细胞数显著减少；而L1D4诱导BV2．mGPRl7细胞的反应性细胞数减少，曲线下面积显著减少。BV2．mGPRl7细胞表达的CysLTl受体显著下调。BV2．mGPRl7细胞的自发吞噬能力减弱，UDP或者m4诱导Bv2一mGPRl7细胞的吞噬能力减弱。IH浙江大学硕：t学位论文中文摘要结论：1．成功构建了稳定转染小鼠GPRl7重组质粒的BV2细胞株。2．稳定转染造成了BV2细胞形态发生明显的改变；GPRl7对Bv2细胞吞噬能力的调节是一种负性的调控．关键词：G蛋白

7、偶联受体17(GPRl7)；Bv2细胞；吞噬；钙内流；基因转染lV浙江大学硕士学位论文英文摘要StablegenetransfectionofGPRl7anditsroleinphagocytosisinmouseBV2microglialcellsZhejiaIlgU11iVerS时Sch00lofMedicineCandidateforMaSterSupervisorDeparclllentofPha册acolog)，W抽gXin—xinW．eiEr-qingAbstractBacl‘gmuds：MicrogliaaretlleimmuneandinnaII