细胞松弛素b和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响

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1、细胞松弛素B和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响：张波，冯贵雪，方伟芬，周红，周莉，甘贤优，刘茵【摘要】【目的】探讨细胞松弛素B和解冻程序对玻璃微细管法（GMP）玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。【方法】以小鼠MII期卵母细胞为模型，研究冷冻前细胞松弛素B预处理、不同解冻程序对小鼠卵母细胞冷冻效果的影响；随后对经GMP玻璃化冷冻的卵母细胞直接进行培养以检测冷冻是否诱发孤雌发育。【结果】与对照组相比，细胞松弛素B预处理的卵母细胞存活率、受精率、卵裂率及囊胚率没有显著差异（89.3%vs91.3%,44.0%vs40.4%,30.0%vs27.7%

2、,4.0%vs6.4%;P>0.05）；采用连续浓度梯度递减解冻法的受精率明显高于间断浓度梯度递减解冻法（57.4%vs40.4%;P<0.05），且前者的卵裂率和囊胚发育率也相对较高(40.2%vs27.7%,14.5%vs6.4%;P>0.05)。冷冻复苏后卵母细胞的孤雌发育率稍高于未经冷冻的卵母细胞(17.1%vs3.2%;P>0.05)。【结论】细胞松弛素B预处理对MII期小鼠卵母细胞的GMP玻璃化冷冻保存效果没有影响；采用连续浓度梯度递减解冻法能明显提高复苏后卵母细胞的体外发育能力。【关键词】卵母细胞；玻璃化冷

3、冻；小鼠；细胞松弛素BAbstract:【Objective】EffectsofcytochalasinBandthaonglassmicropipette(GMP)vitrificationofmousematureoocytesentandthaonviabilityandinvitrodevelopmentofmaturedmouseoocytesent.【Results】paredtothecontroledgroup,Thesurvivalrate,fertilizationrate,cleavagerate,andblastocys

4、trateofcytochalasinBpre-treatmentofconsecutive-decreaseconcentrationouseoocytesproducingparthenogeicaldevelopment,butnotsignificantlydifferentousematureoocytesprovedifpre-vitrificationtreatmentofconsecutive-decreaseconcentrationmethodprovetheinvitrodevelopmentalabilityofmous

5、eoocytes.Keyouse；cytochalasinB卵母细胞冷冻保存是人类辅助生殖领域中研究的热点和难点问题。自1986年Chen首次报道人成熟卵母细胞冻融后成功分娩以来，许多研究者虽然对卵母细胞冷冻进行了大量的研究，但进展缓慢。近年来，玻璃化冷冻技术由于其简单、方便、不需要昂贵冷冻仪器等优点已逐渐进入到人类生殖领域[1-3]，在人卵母细胞冷冻保存方面表现出独特的优势并产下健康的婴儿[4-6]，尽管如此，该技术仍有待进一步成熟，许多基础问题有待深入研究。本实验拟采用本中心所建立的玻璃微细管（glassmicropipette，GMP）玻

6、璃化冷冻方法[7,8]，以小鼠MII期卵母细胞为模型，研究细胞松驰素B、解冻程序和冷冻对卵母细胞发育的影响，以期为人类探索一种简易、高效的卵母细胞冷冻保存方法。1材料与方法1.1实验动物5~6周龄的雌性小鼠(广西医科大学实验动物中心提供)。1.2方案设计1.2.1细胞松弛素B对小鼠卵母细胞冻融效果的影响试验分为两组：对照组采用GMP法对小鼠MII期的卵母细胞直接进行玻璃化冷冻；处理组在冷冻前用细胞松弛素B（5μg/mL）预处理5min后再进行玻璃化冷冻保存。两组均用间断浓度梯度递减解冻法进行复苏。复苏后通过卵母细胞的存活率、受精率、卵裂率及囊胚

7、率来评定细胞松弛素B对卵母细胞冻融效果的影响。1.2.2复苏方法对小鼠卵母细胞冻融效果的影响试验分为两组：一组是“间断浓度梯度递减解冻法”（对照组），即将卵母细胞由高浓度向低浓度逐步转移的方法。另一组是“连续浓度梯度递减解冻法”（试验组），即复苏时将两种不同浓度的解冻液连接在一起，由于浓度差的存在，高浓度的解冻液向低浓度渗透从而形成了液流，卵母细胞随着此液流由高浓度一侧漂向低浓度一侧的方法。复苏后通过卵母细胞的存活率、受精率、卵裂率及囊胚率来评定复苏方法对卵母细胞冻融效果的影响。1.2.3玻璃化冷冻诱发卵母细胞孤雌发育的观察试验分为两组：对照组

8、将卵母细胞直接置于培养液中，观察是否出现单原核或/和卵裂；试验组将经过GMP玻璃化冻融后的卵母细胞置于培养液中，观察是否出现单原核或/和卵裂。1.3卵