细胞松弛素b和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响论文

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1、细胞松弛素B和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响论文张波，冯贵雪，方伟芬，周红，周莉，甘贤优，刘茵【摘要】【目的】探讨细胞松弛素B和解冻程序对玻璃微细管法（GMP）玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。【方法】以小鼠MII期卵母细胞为模型，研究冷冻前细胞松弛素B预处理、不同解冻程序对小鼠卵母细胞冷冻效果的影响；随后对经GMP玻璃化冷冻的卵母细胞直接进行培养以检测冷冻是否诱发孤雌发育。【结果】与对照组相比.freelonglassmicropipette(GMP)vitrificationofmousematureoocytesentandthaonviabilityandinvitrod

2、evelopmentofmaturedmouseoocytesent.【Results】paredtothecontroledgroup,Thesurvivalrate,fertilizationrate,cleavagerate,andblastocystrateofcytochalasinBpre-treatmentofconsecutive-decreaseconcentrationouseoocytesproducingparthenogeicaldevelopment,butnotsignificantlydifferentousematureoocytesprovedif

3、pre-vitrificationtreatmentofconsecutive-decreaseconcentrationmethodprovetheinvitrodevelopmentalabilityofmouseoocytes.Keyouse；cytochalasinB卵母细胞冷冻保存是人类辅助生殖领域中研究的热点和难点问题。自1986年Chen首次报道人成熟卵母细胞冻融后成功分娩以来，许多研究者虽然对卵母细胞冷冻进行了大量的研究，但进展缓慢。近年来，玻璃化冷冻技术由于其简单、方便、不需要昂贵冷冻仪器等优点已逐渐进入到人类生殖领域1-3，在人卵母细胞冷冻保存方面表现出独特的优势

4、并产下健康的婴儿4-6，尽管如此，该技术仍有待进一步成熟，许多基础问题有待深入研究。本实验拟采用本中心所建立的玻璃微细管（glassmicropipette，GMP）玻璃化冷冻方法7,8，以小鼠MII期卵母细胞为模型，研究细胞松驰素B、解冻程序和冷冻对卵母细胞发育的影响，以期为人类探索一种简易、高效的卵母细胞冷冻保存方法。1材料与方法1.1实验动物来源5~6周龄的雌性小鼠(广西医科大学实验动物中心提供)。1.2方案设计1.2.1细胞松弛素B对小鼠卵母细胞冻融效果的影响试验分为两组：对照组采用GMP法对小鼠MII期的卵母细胞直接进行玻璃化冷冻；处理组在冷冻前用细胞松弛素B（5μg/mL

5、）预处理5min后再进行玻璃化冷冻保存。两组均用间断浓度梯度递减解冻法进行复苏。复苏后通过卵母细胞的存活率、受精率、卵裂率及囊胚率来评定细胞松弛素B对卵母细胞冻融效果的影响。1.2.2复苏方法对小鼠卵母细胞冻融效果的影响试验分为两组：一组是“间断浓度梯度递减解冻法”（对照组），即将卵母细胞由高浓度向低浓度逐步转移的方法。另一组是“连续浓度梯度递减解冻法”（试验组），即复苏时将两种不同浓度的解冻液连接在一起，由于浓度差的存在，高浓度的解冻液向低浓度渗透从而形成了液流，卵母细胞随着此液流由高浓度一侧漂向低浓度一侧的方法。复苏后通过卵母细胞的存活率、受精率、卵裂率及囊胚率来评定复苏方法对卵

6、母细胞冻融效果的影响。1.2.3玻璃化冷冻诱发卵母细胞孤雌发育的观察试验分为两组：对照组将卵母细胞直接置于培养液中，观察是否出现单原核或/和卵裂；试验组将经过GMP玻璃化冻融后的卵母细胞置于培养液中，观察是否出现单原核或/和卵裂。1.3卵母细胞的采集对雌性小鼠进行超排处理间隔48h分别每只注射10IU的孕马血清促性腺激素（pregnantmareserumgonadotropin,PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（humanchorionicgonadotropin,hCG)］，注射hCG后15h颈椎脱臼处死小鼠，剖腹取出输卵管，在实体镜下用眼科镊将输卵管膨大部撕破，卵丘卵母细胞复合体

7、自动排出。将其移入含75IU/mL透明质酸酶的培养液中处理40~50s，用稍大于卵母细胞的吸管反复吹打以去除卵母细胞周围的卵丘细胞，然而用基础液清洗5~6遍，收集形态正常、有第一极体的卵母细胞移入培养液以供实验使用。本试验按照此方法共处理14只小鼠，获卵396枚，经过筛选后用于本试验的共351枚。1.4卵母细胞的玻璃化冻融卵母细胞首先在玻璃化1液（200mL/L人血清蛋白的基础液，V1）中洗涤2次，移入玻璃化2液（75mL乙二醇和75mL二甲亚砜，V2）中