玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响论文

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1、玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响论文【摘要】目的:通过比较玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞冷冻复苏、体外成熟、胚胎发育及细胞骨架的影响，寻求最佳的卵子冷冻方案。方法：玻璃化冷冻生殖泡期卵(GV)、成熟中期卵（MⅡ）及体外成熟卵(IVM-MⅡ），解冻复苏后，分别作体外成熟、体外受精（IVF）、胚胎培养或固定作免疫荧光标记，统计复苏率、成熟率、受精率、囊胚率、细胞骨架正常率。结果：GV冷冻组、MⅡ冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组复苏率差异无显著性（65%vs60.92%vs69.93%，P0.05）。GV冷冻组的成熟率显著低于对照组（79.6%v

2、s96.19%，P0.01）。GV冷冻组、MII冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组受精率均明显低于对照组（P0.01），且IVM-MⅡ冷冻组受精率显著低于MⅡ冷冻组（18.06%vs31.34%.freelaturation(IVM)，developmentandcytoskeletonofmousefrozen-thaostsuitablecryopreservationprotocol.Methods:MⅡ，GVandIVM-MⅡaturation，invitrofertilization，embryocultivationorfixedforimmun

3、ofluorescence.Theratesofsurvival，maturation，fertilization，blastulationandcytoskeletonalconfigurationaturationrateofGVgroupalfeatureofspindlesandchromosomesbetuchloentalcapacityofGVooctyesouse卵子冷冻能避免胚胎冷冻带来的伦理问题，而且增加供卵来源，并为那些因疾病需要切除卵巢或推迟生育的妇女提供生殖保险。卵子结构复杂，冷冻极易造成其不可逆的病变甚至死亡，卵母细胞成熟状态

4、也会影响卵子冷冻结果。成熟卵子和未成熟卵因其结构不同，对冷冻的耐受性也不同。理论上，冷冻未成熟GV卵似乎是更好的选择，但是也有报道指出GV卵对冷冻更为敏感1-2。因此本研究结合胚胎学和细胞骨架指标，探讨成熟阶段对卵子冷冻结果的影响以及GV卵冷冻时机的选择。1材料和方法1.1溶液的配制玻璃化冷冻的基础液为含20%胎牛血清（FCS）（北京中杉金桥生物技术有限公司）的磷酸盐缓冲液（PBS），体外成熟液（MEM）为含50μg/ml青霉素、75μg/ml链霉素、0.3mol/L丙酮酸钠、200mmol/L谷氨酰胺、20%FCS、0.075IU/mlFSH及1IU/

5、mlhCG的α-MEM溶液，受精液为含4mg/ml牛血清白蛋白（BSA）的KSOM液，卵裂液为含1mg/mlBSA的KSOM液，KSOM液的配制见文献3。除FCS外，其余试剂均来自美国Sigma公司。1.2实验动物昆明小白鼠，控制光照和黑暗各12h，雌鼠体重20～25g，雄鼠体重30～35g。1.3卵的收集雌鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG）（宁波第二激素厂），10IU/只，44～48h后处死，刺破卵巢表面卵泡，收集生殖泡期（GV）卵置于MEM中，或再注射hCG，5IU/只，16～18h后处死，刺破输卵管的膨大部，收集中期成熟卵（MII）。1.4玻

6、璃化冷冻和解冻冷冻：室温下将卵子在PBS+20%FCS(S)中冲洗2～3次后移入10%乙二醇（EG）＋10%二甲基亚砜（DMSO）中停留30s，然后移入20%EG＋20%DMSO＋0.5mol/L糖中，用SOPS（超薄型开口拉细麦管，MINITUB，Germany）通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。解冻：在室温下依次将卵子移入含0.4mol/L糖、0.2mol/L糖、0.1mol/L糖的S及S中，各停留3min，再于37℃S中停留5min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟（IVM）、体外受精（IVF）或固定作免疫荧光标记。1.5IVMGV卵置于MEM

7、中，在CO2培养箱中培养24h后，剥除颗粒细胞，观察到排出第一极体者为MII。1.6细胞骨架免疫荧光标记各组MII卵剥除颗粒细胞，予3%多聚甲醛固定，于0.5%TritonX-100(0694，Amresco)中室温下孵化20min，随后依次在37℃下1:100α-微管蛋白单克隆抗体(ZM-0438，北京中杉金桥生物技术有限公司)孵化2h，1:100FITC标记的山羊抗鼠IgG(ZF-0312，北京中杉)避光孵化1.5h，20μg/ml碘化吡啶（PI，ZLI-9038，北京中杉)避光孵化15min，最后以30%甘油装片观察。1.7分组分四组，对照组为新鲜

8、GV卵体外培养成熟（IVM）；GV冷冻组为GV卵剥除颗粒细胞后行玻璃化冷冻，解冻