鹿角脱盘蛋白的提取工艺研究论文

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1、鹿角脱盘蛋白的提取工艺研究论文幺宝金，赵雨，牛放，黄萍，杨菲，李娟【摘要】目的建立鹿角脱盘蛋白提取工艺。方法采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)，考察不同pH值、不同料液比、不同浸提时间、不同盐浓度等影响因素对蛋白提取效果的影响。结果鹿角脱盘蛋白的提取工艺为：pH值12的缓冲液(含50mMEDTA、0.5MNaCl)浸提，料液比为1∶5.freelSikaantlerbase.MethodsSDS-polyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE),pactsonpro

2、teinextraction,includingpHvalues,solid-liquidratio,extractiontimes,saltconcentrationandotherfactors.ResultsTheextractionprocessaterialsmol/LEDTAand0.5mol/LNaCl,eachtimeadding5timesamountofbuffersolutionandextracting3h.ConclusionTheyieldofproteinscanbeupto2%,andp

3、uritycanalsobeupto80%.Theoptimumprocessobtainedissteady,reasonableandfeasible.Keyminck额骨上的角根与由此而生的鹿茸之间的平环状突起物，具有补肝肾、益脾胃、强筋壮骨、镇痛散癖、行血消肿、软坚散结、消除乳房痞块之功效，民间常用于治疗乳腺炎、恶疮、痈肿等1。目前，对于鹿角脱盘的化学成分及药理作用研究并不深入，在很大程度上限制了鹿角脱盘产品的开发。在前期工作中，我们对鹿角脱盘蛋白进行了质谱分析和数据库检索，表明鹿角脱盘蛋白含有多种活性蛋白，如

4、抗菌肽Cathelicidin、肽聚糖识别蛋白等。本课题针对鹿角脱盘中的蛋白及多肽类成分进行分离纯化和鉴定，结合其临床应用进行药理和药效学研究，为鹿角脱盘产品的进一步开发和利用提供科学依据。本文报道为鹿角脱盘蛋白的提取工艺部分。1仪器与材料梅花鹿鹿角脱盘，购自吉林省东风药业有限公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰胺、甘油、甘氨酸购自Sigma公司;过硫酸铵(AmmoniumPersulfate)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、β-巯基乙醇(β-Mercaptoethan

5、ol)、考马斯亮蓝R250(CoomassieBlueR250)、溴酚蓝购自Amresaco公司;低分子量标准蛋白质(包括6种标准蛋白，相对分子质量分别为97.4，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4kDa)，购于中国科学院上海生物化学研究所;其它试剂均为分析纯。TDL-5型台式大容量离心机(上海安亭科学仪器厂);CP225D型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);DYY-8C型电泳仪(北京六一仪器厂);LL3000型冷冻干燥机(德国Heto公司);高速离心机(Eppendorf公司);电泳仪、垂直板电

6、泳槽(北京六一仪器厂)。2方法与结果2.1不同浸提pH值对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉12份，每份300mg。分别加入pH3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0的缓冲溶液，按料液比1∶10浸提，时间为3h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6000r·min-1离心15min，上清液合并，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，结果见图1由图1可知，当pH值为12时，提取出的鹿角脱盘蛋白条带最多。因此在浸提过程中选用pH值为12的缓冲溶液进行浸提。2.2不

7、同浸提料液比对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉4份，每份300mg。加入pH12的缓冲溶液浸提，料液比(arker、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11、pH12Marker分子量自上而下依次为：97.4，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4kDa图1不同浸提pH值对蛋白提取效果的影响从左至右样品顺序依次为：Marker、料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20Marker分子量自上而下依次为：97.4，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4kDa图2不

8、同浸提料液比对蛋白提取效果的影响从左至右样品顺序依次为：Marker、3、6、8、12、24hMarker分子量自上而下依次为：97.4，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4kDa图3不同浸提时间对蛋白提取效果的影响由图3可知，浸提时间长短对提取出的鹿角脱盘蛋白条带影响很小，因此在浸提过程中选择浸提时间为3h。2.4不