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1、鹿角脱盘药理研究分析论文摘要:文章分析了鹿角脱盘蛋白提取工艺主题词:鹿角托盘蛋白提取鹿角脱盘(Sikaantlerbase)作为鹿产品的一种,是雄性梅花鹿CervwnipponTemminck额骨上的角根与由此而生的鹿茸之间的平环状突起物,具有补肝肾、益脾胃、强筋壮骨、镇痛散癖、行血消肿、软坚散结、消除乳房痞块之功效,民间常用于治疗乳腺炎、恶疮、痈肿等。目前,对于鹿角脱盘的化学成分及药理作用研究并不深入,在很大程度上限制了鹿角脱盘产品的开发。本文报道为鹿角脱盘蛋口的提取工艺部分。一仪器与材料梅花鹿鹿角脱盘,购自吉林省东风药业有限公司;三免甲基
2、氨基甲烷(Tris).十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰胺、甘油、甘氨酸购自Sigma公司;过硫酸钱(AmmoniumPersulfate)>N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED).B-毓基乙醇(B-Mercaptoethanol)、考马斯亮蓝R250(CoomassieBlueR250)>滉酚蓝购自Amresaco公司;低分子量标准蛋白质(包括6种标准蛋白,相对分子质量分别为97.4,66.2,43.0,31.0,20.1,14.4kDa),购于中国科学院上海生物化学研究所;其它试剂均为分析纯。TDL-5型台式大容量离心机(上海安亭科
3、学仪器厂);CP225D型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);DYY-8C型电泳仪(北京六一仪器厂);LL3000型冷冻干燥机(德国Heto公司);高速离心机(Eppendorf公司人电泳仪、垂直板电泳槽(北京六一仪器厂)。二、方法与结果1、不同浸提pH值对蛋白提収效果的影响精密称取鹿角脱盘粉12份,每份300mgo分别加入pII3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,11.0,12.0的缓冲溶液,按料液比1:10浸提,时间为3h,浸提次数为两次,提取温度4°C,6000r?min-l离心15min,上清液合并
4、,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,当pH值为12时,提取出的鹿角脱盘蛋白条带最多。因此在浸提过程中选用pH值为12的缓冲溶液进行浸提。2、不同浸提料液比対蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉4份,每份300mgo加入pH12的缓冲溶液浸提,料液比(W/V)分别为1:5,1:10,1:15,1:20,时间为3h,浸提次数为两次,提取温度4°C,6000r?min-l离心15min,上清液合并,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。料液比为1:5和1:10时提取出的鹿角脱盘蛋白条带最多,但差别并不明显,因此在
5、浸提过程中选择料液比为1:5O3、不同浸提时间对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉5份,每份300mgo加入pH12的缓冲溶液浸提,料液比1:5,时间依次为3,6,8,12,24h,时间为3h,浸提次数为两次,提取温度4°C,6000r?min-l离心15min,上清液合并,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。。从左至右样品顺序依次为:Marker^pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pHll、pH12Marker分子量自上而下依次为:97.4,66.2,43.0,31.0,20.1,14.4
6、kDa4、不同浸提盐浓度对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉10份,每份300mgo其中5份依次加入含EDTA10,20,30,40,50mmol/L的pH12的缓冲溶液浸提,另5份依次加入含NaCl0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mol/L的pII12的缓冲溶液浸提,料液比为1:5,时间为3h,浸提次数为两次,提取温度4°C,6000r?min-l离心15min,上清液合并,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,随着EDTA浓度的增加,提取出的鹿介脱盘蛋白条带也越来越多,当达到50mmol/L时提取效果最好,因此确定
7、浸提时EDTA的浓度为50mmol/L;随着NaCl浓度的增加,提取出的鹿角脱盘蛋白条带也越來越多,当达到0.5mol/L时提取效果最好,因此确定浸提时NaCl的浓度为0.5mol/L0综上所述,鹿角脱盘蛋白的提取工艺确定为:pH值12的缓冲液(含50mmol/LEDTA、0.5MNaCl)浸提,料液比为1:5,浸提时间为3h,浸提次数2次。5、验证试验称取鹿角脱盘粉3份,每份5g,按上述工艺进行提取,经80%硫酸鞍沉淀,透析后冻干,采用Bradford法测定蛋白含量,收率及纯度。三、讨论近年来,随着人们生活水平的提高和大众健康、保健意识的增
8、强,对鹿角盘的化学成分、功能评价、夯理作用等进行了一定的研究。由于鹿角脱盘是鹿茸骨化后的产物,含有大量钙磷等化合物,构成了坚硬的结构,使得包含其中的蛋白等有效成分难