霍乱弧菌新类型溶源性噬菌体基因组结构研究论文

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1、霍乱弧菌新类型溶源性噬菌体基因组结构研究论文芮勇宇，阚飙，高守一，刘延清，祁国明【关键词】霍乱弧菌；噬菌体；序列分析,摘要：目的研究霍乱弧菌埃尔托型（EVC）新类型溶源性噬菌体（CTXφ）和核心区不含ctxAB基因的溶源性噬菌体（nct-CTXφ）基因组的结构。方法采用基因扩增、测序及序列生物信息学等方法进行观察与分析。结果在我国EVC中，存在仅携带古典型（class）nct-CTXφ、CTXφ或埃尔托型（ET）CTXφ基因组类型，并发现nct-CTXclassφ和CTXETφ共存、nct-CTXneesAbstract：ObjectiveTostudyonstructures

2、ofneesofEITorbiotypevibriocholerae.MethodsPCR,sequencingandsequenceanalysisetype,nct-CTXclassφandCTXETφ,nct-CTXneescoexistedtypesinEITorstrainsisolatedfromChinaeescoexistedtypesinEITorpPCRsystem9600型PCR扩增仪（美国PE公司）；GDS7500型凝胶成像仪(英国UVP公司)。12方法121引物设计利用Oligo60软件进行引物设计，引物在上海生工公司合成。扩增片断分别为：（1）上游引

3、物CTRS上5′-ATTGACAGGATGAAGGATACC-3′，下游引物rstA下5′-CGGAATTCTCGACATCAAATGGCATG-3′，用于扩增CTXφ基因组串联体的第1个基因组末端和第2个起始端之间的基因，扩增片断简称为CR，约1500bp，片段包括ctxB3′端部分基因、ig1、rstR、ig2和rstA5′端部分基因。（2）上游引物ZCT上5′-GCTACAAGGTGCTACCGTTAC-3′，和引物rstA下配对，用于扩增nct-CTXφ基因组串联体的第一个基因组末端和第2个起始端之间的基因，扩增片断简称为ZR，约1500bp，包括zot3′端部分基因、

4、ig1、rstR、ig2和rstA5′端部分基因。对CR和ZR扩增产物进行酶切鉴定，内切酶选用RsaI和BglII。（3）上游引物TLC上5′-CTTGGATTAAGTCAACCAGAG-3′，和引物rstA下配对，扩增片断简称为TR，约20kb，包括TLC基因簇3′端部分基因、ig1、rstR、ig2和rstA5′端部分基因。对扩增产物进行酶切鉴定，内切酶选用RsaI和BglII。（4）ctxAB基因分段扩增：利用ZCT上和ZCT下5′-GTGTGTTGTGGTATTCTGCAC-3′，引物CTB上5′-GGTGTAAAATTCCTTGACG-3′和CTB下5′-GCTTCT

5、CATCATCGAACC-3′扩增，扩增片段分别约1000和550bp。（5）tcpA基因扩增：引物tcpA上为5′-AGAACACGATAAGAAAACCG-3′和tcpA下5′-AACGCTGGATTTGAGATGAC-3′，扩增片段约900bp。122PCR扩增及酶切PCR反应体积50μl，1×PCR缓冲液，100μmoldNTP，05μmol引物，10UTaqDNA聚合酶，模板约100ng（采用SDS裂解-酚氯仿抽提-乙醇沉淀方法制备）。PCR扩增的循环参数为：94℃5min；94℃15s，60℃15s，72℃30s～2min，30个循环；72℃5min。扩增产物在10

6、%的琼脂糖凝胶上（含05μg/ml溴乙锭）电泳，长波紫外线下观察并将PCR产物条带割下，利用试剂盒回收凝胶中PCR产物，回收的PCR产物直接作为测序模板。直接对PCR产物进行酶切，按内切酶试剂盒说明书操作，酶切产物同上电泳，紫外灯下观察并拍照。123PCR产物测序及序列分析提供PCR扩增产物和扩增用引物作为测序引物，由上海博亚公司测序，对PCR产物直接测序。序列拼接及生物信息学分析应用DNAStar软件分析，网上同源比较应用ncbinlmnihgov网站BLASTn序列分析软件。2结果21CR和ZR基因扩增产物酶切及测序结果（图1，图2）图1可见，扩增双拷贝nct-CTXφ基因

7、组的ZR产物经酶切分析共分为2种类型，经测序表明rstR-ig2分别为class和neseyHH,DavisBM,etal.CTXphiandVibriocholerae:exploringaneallchromosomesofenvironmentalvibriocholeraenon-O1,non-O139strains［J］.EnvironMicrobiol,2006,8(3):526-634.〔6〕芮勇宇,阚飙,高守一,等.霍乱弧菌CTXφ基因组抑制子基因多态性分析［J］.中国预防医