荔枝核总皂苷体外抗乙型肝炎病毒的作用

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1、荔枝核总皂苷体外抗乙型肝炎病毒的作用蒋蔚峰，陈建宗，张娟，张金平，贾新【摘要】目的：观察荔枝核总皂苷体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法：以HepG2.2.15细胞为靶细胞，分别用不同浓度的荔枝核总皂苷和拉米夫定培养液培养，采用ELISA法及荧光定量PCR法测定细胞培养上清HBsAg,HBeAg及细胞外HBVDNA含量，评价荔枝核总皂苷对体外HBV的抑制作用.结果：荔枝核总皂苷对体外培养HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg,HBeAg及细胞外HBVDNA的50％抑制浓度(IC50)分别为0.096，0.085和0.128g/L，治疗指数(TI)分别为6.

2、98，7.88和5.23.0.25g/L拉米夫定组和0.4g/L荔枝核总皂苷组在d3，d6对体外培养HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg，HBeAg及细胞外HBVDNA的抑制作用差异无统计学意义（P＞0.05）.结论：荔枝核总皂苷具有一定的体外抗HBV作用.【关键词】荔枝核；皂苷类；HepG2.2.15细胞；肝炎病毒，乙型0引言　　我国属乙型病毒性肝炎高流行区，2004年中国疾病预防控制中心调查显示我国HBsAg感染率高达9.09％［1］.目前，尚没有理想的治疗慢性乙型肝炎的药物.我国有数千年应用中草药治疗疾病的传统和经验，从中已发现了不少抗乙型肝炎病毒(H

3、BV)的药物.荔枝核是无患子科植物荔枝（LitchichinensisSonn）的成熟种子，又名荔仁或荔核，味甘、微苦，归肝、肾经，具有行气散结、祛寒止痛的功效.其化学成分包括皂苷、蒜质和脂肪酸等多种物质.研究发现，荔枝核黄酮类提取物对乙肝病毒HBsAg，HBeAg以及HBVDNA有明显的抑制作用［2-3］.但荔枝核皂苷是否具有抑制HBV的作用，目前尚未见文献报道.我们采用HepG2.2.15细胞为靶细胞，观察不同浓度荔枝核总皂苷体外对HBV的抑制作用.1材料和方法1.1材料HepG2.2.15细胞由第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心王平忠博士惠赠；噻唑蓝(

4、MTT)，二甲基亚砜(DMSO)和G418(Sigma公司)；HBsAg和HBeAg的ELESA检测试剂盒(华美生物公司)；Model1680酶联免疫检测仪(德国Bio?Rad公司)；HBVDNA提取及扩增荧光检测试剂盒(广州中山大学达安基因股份有限公司)；DMEM高糖培养液、胰蛋白酶、EDTA、L?谷氨酰胺、胎牛血清(Gibco公司)；PE7700型自动荧光PCR检测仪(美国PerkinElmer公司).荔枝核总皂苷由第四军医大学药剂科提取，实验时用DMSO溶解后再以含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液稀释，分别配制成0.4，0.2，0.1，0.05，0.

5、025g/L共5个浓度梯度，含药培养液中DMSO浓度不超过10g/L.拉米夫定由葛兰素史克制药有限公司提供，实验时用培养液稀释成0.25g/L.1.2方法HepG2.2.15细胞培养于DMEM高糖培养液(含100mL/L胎牛血清，400mg/LG418及0.3g/L谷氨酰胺，56g/L碳酸氢钠调pH值至7.2)中，培养于37℃，饱和湿度，50mL/LCO2，每72h更换培养液1次.细胞长满瓶底约80%，用2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/LEDTA1∶1混合消化3～5min，1∶3分瓶传代.取对数生长期状态良好的细胞，调整细胞浓度为1×107个/L，接种于96孔板

6、，每孔0.2mL，培养箱培养24h，待细胞贴壁后进行实验.荔枝核总皂苷按配制不同浓度分组，同时设仅加细胞培养液的阴性对照组和含0.25g/L拉米夫定的阳性对照组，每组设3个复孔.d3更换同样浓度含药培养液及对照培养液1次.各孔用药d3，d6将吸取的上清液置于-20℃冰箱保存待检.另分别收集贴壁后1～6d的细胞培养上清，-20℃保存，统一检测.使用ELISA法检测培养上清的HBsAg和HBeAg，显色反应后，酶标仪读取A450nm值，绘制分泌曲线.1.2.1药物对细胞毒性试验荔枝核总皂苷配制成0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125，0.

7、00625g/L共8个浓度梯度，HepG2.2.15细胞以1×107个/L接种于96孔培养板，细胞贴壁后各药物组换入相应含药培养液，阴性对照组换入正常培养液.于加药d6吸去上清液，每孔加5g/LMTT20μL，37℃孵育4h，弃上清液后每孔加入DMSO150μL，震荡10min，测A490nm值.计算细胞存活率(％)=(实验组A490nm值/阴性对照孔A490nm值)×100％；半数中毒浓度(TC50)=Antilog［logB+(50-B)的抑制百分率/(A-B)的抑制百分率×C］，(A≥抑制50％药物浓度，B≤抑制50％药物浓度，C=log稀释倍数).1.2

8、.2上清液HBsAg和H