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时间:2018-07-08
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1、荔枝核总皂苷体外抗乙型肝炎病毒的作用蒋蔚峰,陈建宗,张娟,张金平,贾新【摘要】目的:观察荔枝核总皂苷体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法:以HepG2.2.15细胞为靶细胞,分别用不同浓度的荔枝核总皂苷和拉米夫定培养液培养,采用ELISA法及荧光定量PCR法测定细胞培养上清HBsAg,HBeAg及细胞外HBVDNA含量,评价荔枝核总皂苷对体外HBV的抑制作用.结果:荔枝核总皂苷对体外培养HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg,HBeAg及细胞外HBVDNA的50%抑制浓度(IC50)分别为0.096,0.085和0.128g/L,治疗指数(TI)分别为6.
2、98,7.88和5.23.0.25g/L拉米夫定组和0.4g/L荔枝核总皂苷组在d3,d6对体外培养HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg,HBeAg及细胞外HBVDNA的抑制作用差异无统计学意义(P>0.05).结论:荔枝核总皂苷具有一定的体外抗HBV作用.【关键词】荔枝核;皂苷类;HepG2.2.15细胞;肝炎病毒,乙型0引言 我国属乙型病毒性肝炎高流行区,2004年中国疾病预防控制中心调查显示我国HBsAg感染率高达9.09%[1].目前,尚没有理想的治疗慢性乙型肝炎的药物.我国有数千年应用中草药治疗疾病的传统和经验,从中已发现了不少抗乙型肝炎病毒(H
3、BV)的药物.荔枝核是无患子科植物荔枝(LitchichinensisSonn)的成熟种子,又名荔仁或荔核,味甘、微苦,归肝、肾经,具有行气散结、祛寒止痛的功效.其化学成分包括皂苷、蒜质和脂肪酸等多种物质.研究发现,荔枝核黄酮类提取物对乙肝病毒HBsAg,HBeAg以及HBVDNA有明显的抑制作用[2-3].但荔枝核皂苷是否具有抑制HBV的作用,目前尚未见文献报道.我们采用HepG2.2.15细胞为靶细胞,观察不同浓度荔枝核总皂苷体外对HBV的抑制作用.1材料和方法1.1材料HepG2.2.15细胞由第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心王平忠博士惠赠;噻唑蓝(
4、MTT),二甲基亚砜(DMSO)和G418(Sigma公司);HBsAg和HBeAg的ELESA检测试剂盒(华美生物公司);Model1680酶联免疫检测仪(德国Bio?Rad公司);HBVDNA提取及扩增荧光检测试剂盒(广州中山大学达安基因股份有限公司);DMEM高糖培养液、胰蛋白酶、EDTA、L?谷氨酰胺、胎牛血清(Gibco公司);PE7700型自动荧光PCR检测仪(美国PerkinElmer公司).荔枝核总皂苷由第四军医大学药剂科提取,实验时用DMSO溶解后再以含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液稀释,分别配制成0.4,0.2,0.1,0.05,0.
5、025g/L共5个浓度梯度,含药培养液中DMSO浓度不超过10g/L.拉米夫定由葛兰素史克制药有限公司提供,实验时用培养液稀释成0.25g/L.1.2方法HepG2.2.15细胞培养于DMEM高糖培养液(含100mL/L胎牛血清,400mg/LG418及0.3g/L谷氨酰胺,56g/L碳酸氢钠调pH值至7.2)中,培养于37℃,饱和湿度,50mL/LCO2,每72h更换培养液1次.细胞长满瓶底约80%,用2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/LEDTA1∶1混合消化3~5min,1∶3分瓶传代.取对数生长期状态良好的细胞,调整细胞浓度为1×107个/L,接种于96孔板
6、,每孔0.2mL,培养箱培养24h,待细胞贴壁后进行实验.荔枝核总皂苷按配制不同浓度分组,同时设仅加细胞培养液的阴性对照组和含0.25g/L拉米夫定的阳性对照组,每组设3个复孔.d3更换同样浓度含药培养液及对照培养液1次.各孔用药d3,d6将吸取的上清液置于-20℃冰箱保存待检.另分别收集贴壁后1~6d的细胞培养上清,-20℃保存,统一检测.使用ELISA法检测培养上清的HBsAg和HBeAg,显色反应后,酶标仪读取A450nm值,绘制分泌曲线.1.2.1药物对细胞毒性试验荔枝核总皂苷配制成0.8,0.4,0.2,0.1,0.05,0.025,0.0125,0.
7、00625g/L共8个浓度梯度,HepG2.2.15细胞以1×107个/L接种于96孔培养板,细胞贴壁后各药物组换入相应含药培养液,阴性对照组换入正常培养液.于加药d6吸去上清液,每孔加5g/LMTT20μL,37℃孵育4h,弃上清液后每孔加入DMSO150μL,震荡10min,测A490nm值.计算细胞存活率(%)=(实验组A490nm值/阴性对照孔A490nm值)×100%;半数中毒浓度(TC50)=Antilog[logB+(50-B)的抑制百分率/(A-B)的抑制百分率×C],(A≥抑制50%药物浓度,B≤抑制50%药物浓度,C=log稀释倍数).1.2
8、.2上清液HBsAg和H
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