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1、蓬甲饮治疗子宫内膜异位症SD大鼠的作用机制探讨论文.freelechanismofPengjiayinpreparationinthetreatmentofectopicendometriuminSDrats.MethodsTostudythemechanismofC溶解,配成每1mL含有效煎煮生药量2.656g的浓度(即高剂量的给药浓度),高压消毒灭菌,置于-4℃冰箱中保存待用。乌丹丸(原名异位痛经丸),北京中医药大学东方医院院内制剂,由丹参、桃仁、三棱、延胡索、莪术、细辛、水蛭、赤芍、牡丹皮、苏木、鳖甲、穿山甲等22味药物组成,水泛成丸,具有活血化瘀、消癥散结、理气止痛之功效
2、,已在临床应用20多年。84g/瓶,北京中医药大学东方医院制剂室提供,批号：(98)京卫药制字052第F-1264号。将药丸磨成细粉,配成每1mL含有原药材2.992g的浓度,高压消毒灭菌,置于-4℃冰箱中保存待用。1.2动物体重为(200±10)g未交配的健康雌性SD大鼠42只,购自北京维通利华实验动物中心,随机分为5组,即空白对照组、蓬甲饮高剂量组、蓬甲饮中剂量组、蓬甲饮低剂量组、乌丹丸组。1.3主要试剂羧甲基纤维素钠(CMC)：北京精求化工有限责任公司提供,批号3405005。原位细胞死亡检测试剂盒；PV-6001辣根酶标记羊抗兔多聚体；PV-6002辣根酶标记羊抗小鼠多聚
3、体；兔抗鼠Caspase3抗体(1∶100稀释)；鼠抗人Survive抗体工作液；DAB显色剂(3-8试剂购于北京中山生物技术有限公司)。1.4造模造模前2d每天给造模组大鼠肌肉注射2mg/mL的苯甲酸雌二醇0.1mL/(kg·d)以诱导大鼠发情,正常对照组大鼠肌注0.9%氯化钠溶液0.1mL/(kg·d)以相同刺激。腹腔注射10%水合氯醛0.35mL/100g以麻醉大鼠。开腹找到子宫,切下左侧子宫角长约1cm,行端对端吻合术。将剥离的子宫内膜组织1.5cm×0.5cm大小的内膜块,缝合在右侧子宫系膜。剩余内膜组织进行组织学检查,以证实植入物为子宫内膜。缝合切口。1.5分组及给药
4、将造模大鼠随机分为5组：空白对照组8只,乌丹丸组9只,蓬甲饮高剂量组9只,中剂量组8只,低剂量组8只。造模组大鼠平均体重无显著差异性。乌丹丸组和蓬甲饮中剂量组大鼠每千克体重给药量相当于成人每千克体重服药量的8倍。乌丹丸组大鼠每日灌服乌丹丸溶液29.92g/kg(1mL/100g)；蓬甲饮高剂量组大鼠每日灌服蓬甲饮26.56g/kg(1mL/100g)；中剂量组大鼠每日灌服蓬甲饮1mL/100g,浓度稀释为高剂量组的1/2；低剂量组大鼠每日灌服蓬甲饮1mL/100g,浓度稀释为高剂量组的1/4。空白对照组每日灌服CMC1mL/100g。各组大鼠均每天固定时间给药,给药4周后,大鼠剩
5、余37只,其中空白对照组8只、蓬甲饮高剂量组8只、中剂量组7只、低剂量组7只、乌丹丸组7只。1.6免疫组化法分析Caspase-3及Survivin蛋白的表达给药4周后,于末次给药1h后取材,取在位、异位内膜,多聚甲醛-戊二醛固定,制备石蜡切片标本。将标本置于37℃恒温干燥箱中烘烤2h后进行免疫组化染色。按SP法染色。参照阳性对照、阴性对照,细胞质或/和细胞膜呈现棕黄色颗粒反应者为阳性,无棕黄色颗粒反应者为阴性。每组选5例染色良好的切片,在显微镜放大40倍下观察,每张切片随机选取5个视野,共25个视野摄入计算机。测量每个视野阳性染色区域的表面积密度,最后计算每组的平均值。1.6统
6、计学方法实验数据应用SPSS10.0统计软件进行统计,各组均数间的差异性用t检验判定,有效率的差异性用卡方检验判定。2结果(见表1～表４)表1各组大鼠在位内膜与异位内膜细胞凋亡率比较(略)注：与空白组比较,*P0.05；与乌丹丸组比较,#P0.05(下同)。表2Caspase-3在在位内膜、异位内膜中的表达(略)表3Survivin在在位内膜、异位内膜中表达(略)注：与同组在位内膜比较,△P0.05。表4异位子宫内膜Caspase-3和Survivin表达情况(略)3讨论细胞凋亡是基因控制的细胞自然死亡。现在普遍认为,细胞凋亡是一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶Caspase级联反应
7、(Cascade)事件的结果,Caspase-3(又称CPP32,apopain)被证实处于该级联反应的下游。对Caspase-3-/-小鼠的研究发现,在Fas诱导下,与凋亡有关的形态学变化,如染色质凝集、细胞皱缩、线粒体肿胀和凋亡小体的形成,明显缺乏或延迟出现,提示Caspase-3参与细胞凋亡的较晚期阶段1,Caspase-9-/-小鼠显型与Caspase-3-/-小鼠特别相似,但症状较重2。从线粒体释放的细胞色素C与Caspase-9、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptoti
