apoe基因缺陷小鼠cuznsod基因cpg岛甲基化探究

《apoe基因缺陷小鼠cuznsod基因cpg岛甲基化探究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、ApoE基因缺陷小鼠CuZnSOD基因CpG岛甲基化探究【摘要】目的检测apoE基因缺陷小鼠肝脏CuZnSOD基因CpG岛甲基化状态，探讨其与动脉粥样硬化发生发展的关系以及在动脉粥样硬化早期基因诊断中的意义。方法ApoE基因缺陷小鼠是用来建立动脉粥样硬化的成熟模型,本实验将18例7周龄apoE基因缺陷雄性小鼠及作为对照的18例7周龄正常的C57BL/6J雄性小鼠分别随机分成三组,在饲养至0周、7周、14周时取其肝脏，运用甲基化特异性PCR（methylation-specificPCR,MSP）法检测肝

2、脏CuZnSOD基因CpG岛甲基化情况。结果不同时间段apoE基因缺陷小鼠与正常的C57BL/6J小鼠CuZnSOD基因CpG岛甲基化差异无统计学意义。结论apoE基因缺陷小鼠肝脏没有发生CuZnSOD基因启动子区CpG岛的异常甲基化，可能CuZnSOD基因启动子区CpG岛的异常甲基化没有参与动脉粥样硬化的发生发展。�【关键词】动脉粥样硬化；CuZnSOD；甲基化�6DNA甲基化是DNA分子复制后的一种共价修饰方式，导致DNA结合蛋白与DNA主螺旋沟的结合能力降低，从而在不改变基因结构的基础上够调控基因

3、的表达。本研究运用甲基化特异性PCR（methylation-specificPCR,MSP）对apoE基因缺陷小鼠与正常的C57BL/6J小鼠肝脏CuZnSOD基因启动子区CpG岛甲基化状态进行检测，以探讨CuZnSOD基因甲基化与AS发生发展的关系。�1材料和方法�1．1标本来源本研究采用7周龄雄性apoE基因缺陷小鼠，该小鼠购自美国Jackson实验室，由中山大学北校区实验动物中心繁殖提供；此外本研究还采用7周龄雄性C57BL/6J小鼠（清洁级）为对照，由中山大学北校区实验动物中心提供。将18只7

4、周龄apoE基因缺陷小鼠和18只正常的7周龄C57BL/6J小鼠饲养一周以适应环境后随机各分成三组，将第一组小鼠处死，余以AIN-93G饲料分别饲养至第7周和第14周处死，分离小鼠肝脏，－80℃冻存待测。�1．2试剂和仪器95％乙醇购自安徽安特生物化学有限公司；氢氧化钠购自广州化学试剂厂；亚硫酸氢钠、氢醌购自Sigma公司；醋酸钠、醋酸购自汕头市化学试剂厂；无水乙醇购自天津富宇精细化工有限公司；DNA提取试剂盒购自TaKaRa公司（日本）;WizardplussvminiprepsDNAPurifica

5、tionsystem购自promega公司；PCR引物由上海生工合成；PerfectShotTMTaq(LoadingdyeMix)、50bpDNALadder6Marker购自Takara公司；琼脂糖购自西班牙Biowest；Tris碱购自Sigma公司；Na2EDTA．2H2O、硼酸购自天津市福晨化学试剂厂；分析天平（SwissMettlerAE160公司）；-80℃低温冰箱（JapanSANYO公司）；低温高速离心机（Germanyeppendorf公司）；梯度PCR仪（GermanyHybaid

6、GmbH公司）；BIO-RAD电泳仪、电泳槽（U．S．ABio-Rad公司）；凝胶成像及分析系统（FranceVilberLourmat公司）。�1．3方法�1．3．1肝脏DNA的提取将分离出来的肝脏取50mg放入研钵中，加液氮研磨至粉末状，然后加入650μlsolutionA和0．9μl的RNaseA1后，再研磨1min。收集650μl研磨好的组织匀浆移至2．0mlcollectiontube中，加入1ml的4℃预冷的solutionC及400μl的solutionB，弃去上层有机相，然后将水相溶液（

7、无色下层）转移至置于collectiontube的Filtercup中，12,000rpm离心1min。最后12,000rpm离心1min洗脱DNA，-20℃保存备用。具体实验步骤严格按照UniversalGenomicDNAExtractionKit(TaKaRa)说明书进行。�1．3．2模版DNA亚硫酸盐修饰取DNA2μg，加双蒸水至46．7μl。然后加入3mol/lNaOH3．3μl，37℃水浴10min，使DNA充分变性。加入10mM氢醌30μl及3mol/lNaHSO352Oμl(pH5．0)

8、（氢醌和NaHSO3要新鲜配制），在上面加矿物油100μl，53℃孵育166h。将处理过的DNA溶液转移至wizardcolumn中过柱，加入54μl双蒸水（65℃）洗脱DNA，在虑液中加入3mol/lNaOH6μl、6μl3mol/l的醋酸钠（pH5．2）、150μl冻无水乙酸，混匀，-40℃5h。4℃13000rpm离心20min，弃去上清液，用75％的冻乙醇洗涤沉淀两次，干燥，然后用30μl双蒸水溶解DNA，储存在-20℃冰箱中待用。