基于ApoE基因敲除小鼠的动脉硬化研究

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1、UDC硕士学位论文学校代码密级10533基于ApoE基因敲除小鼠的动脉硬化研究AtherosclerosisresearchbasedonApoEgeneknockoutmice本工作在深圳湘雅生物医药研究院完成作者姓名：王敏学科专业：生理学研究方向：动脉粥样硬化学院(系、所)：基础医学院指导教师：谭孟群答辩委员会主席中南大学2013年5月原创性声明fIIIIrlllIrllllllllIlUIIIIIY2422736本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含

2、其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：一至二致一日期：』壅握年』月盈曰学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签

3、名：边导师签名摘要目的：动脉粥样硬化发生机制复杂。目前AS的主要治疗方法是手术治疗和他汀药物治疗，手术可缓解组织缺血但无法改变AS病程，他汀药物可降低血清LDL．C水平但对人体存在一些副作用。本课题组拟采用基因或细胞干预的方式对动脉粥样硬化模型小鼠进行治疗并检测评估其效果，致力于寻找更好的治疗方案。方法与结果：高脂饲料喂养ApoE．／．小鼠四个月，饲养前后分别称量小鼠体重、检测血脂水平，处死部分小鼠后取腹主动脉和肝脏，HE染色观察组织结构改变。结果显示：高脂饲养组小鼠体重减轻；血脂明显上升；腹主动脉内膜增厚，有斑块形成；肝脏结构紊乱，大部分肝细胞肿胀呈

4、气球样变，并可见肝细胞空泡变性。结果表明动脉粥样硬化小鼠模型建立成功。采用PEI方法，三质粒共转染HEK293细胞，分别包装了rAAV-PONl、rAAV-PONl．ApoAl两种病毒并用超速离心层析法对其纯化，real．timePCR法检测其滴度，转染MSCs检测其活性。结果表明本实验获得了较高纯度、较高滴度和较好活性的病毒，可用于后续实验。采用全骨髓贴壁法体外培养C57BL／6小鼠EPCs。显微镜下观察培养的EPCs细胞形态成鹅卵石状；免疫组化检测vWF和flk．1表达为阳性；免疫荧光鉴定结果表明所培养细胞具有吞噬Dil．ac．LDL和摄取FITC

5、．UEA．1的能力，可用于对动脉粥样硬化模型小鼠进行细胞治疗。将rAAV-PONl、rAAV-PONl．ApoAl、EPCs分别经尾静脉注射到模型小鼠体内。治疗四个月后，检测小鼠体重、血脂水平，real．timePCR法检测ApoAl、PONl、eNOS、CRP基因表达，Western．blot法检测人PONl蛋白在小鼠体内的表达，HE染色观察腹主动脉和肝脏组织结构，免疫组织化学染色法测定(It．actin和MAC．3表达。结果表明单、双基因和EPCs对AS都起一定干预作用，其中单基因效果优于其它组，干预效果最为明显。结论：本课题组建立了动脉粥样硬化小

6、鼠模型，体外分离并培养了与模型鼠同品系的C57BL／6小鼠的EPCs，包装了重组腺相关病毒，采用基因干预和细胞干预分别对模型小鼠进行治疗。研究结果表明rAAV-PONl、rAAV-PONl．ApoAl和EPCs对动脉粥样硬化小鼠都有一定的干预效果。其中单基因治疗效果最好。关键词：动脉粥样硬化；腺相关病毒；基因治疗；内皮祖细胞IIIObjeetive：AbstractAtherosclerosisisamultifactorialdisease，SOfar,forwhichthereisnoeffectivetherapeuticmethod．Thisr

7、esearchintendstousegenetherapyandcelltherapytotreatatherosclerosisinmiceandtestingtoassesstheircurativeeffect．Thisprojectintendstoselectthebettertherapeuticmethods．MethodsandResults：ApoE一／-micewerefedwithhighfatdietforfourmonths．Beforeandafterfeeding，themicewereweighedandthebloo

8、dlipidlevelsweredetected．Theresultsshowedthatth