快速斑点免疫渗滤试验诊断日本血吸虫病的初步研究论文

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1、快速斑点免疫渗滤试验诊断日本血吸虫病的初步研究论文.freeliasisjaponicumbyfast-dot-immunofiltrationassay(FDIFA)andlookforoptimalantigenstodiagnosethisdisease.MethodsTheroughandfractionalantigensofmaleandfemaleandeggofSchistosomajaponicumsof33schistosomiasisand32healthycontrolsandotherparasitoses(15cases).paredt

2、hesensitivityandspecificityoftheseantigens.ResultsAllfractionalantigenshavegoodsensitivityandspecificity.ConclusionFractionalantigensofeggofSchistosomajaponicummaybeappliedtodiagnosisofschistosomiasis.FDIFAethodfordiagnosisofschistosomiasis.【Keyajaponicum；FDIFA；ELISA；fractionalangtige

3、ns；ELISA日本血吸虫病（以下简称血吸虫病）分布广泛，危害严重。近年来由于受多种因素影响，我国江湖洲滩地区有螺面积时有增加，人群感染血吸虫人数明显增多，疫情仍呈上升趋势。传统的病原学方法和常规免疫诊断技术在诊断病人、监测疫情和大规模流行病学调查方面难以适应血防工作的需要。因此，研制简便、快速、准确、价廉，便于在疫区推广应用、具有普查、临床实验诊断和疗效考核价值的检测方法是当前搞好血防工作的前提条件之一。常规ELISA法自20世纪70年代开始应用于血吸虫病诊断，具有较好的敏感性和特异性。但因操作步骤多，实验时间长，且需要一定的设备，故较难在基层和现场推广使用。为

4、了提高ELISA检测速度，更便于基层及现场调查时使用，笔者根据ELISA的实验原理和本室在测姜片虫病时的免疫学方法［1］，稍加改进，建立了快速斑点免疫渗滤试验(Fast-dot-immunofiltrationassay，FDIFA)，应用于血吸虫病的实验诊断，并与常规ELISA法作比较，取得了初步效果。现报告如下。1材料与方法1.1血清来源(1)33份血吸虫病患者（均粪便孵化阳性）血清均由湖南省血吸虫病防治研究所提供。(2)32份健康人血清采自本校2004年入学体检的非疫区新生。(3)肝吸虫病、肺吸虫病及猪囊虫病患者血清各5份，均由中国疾病预防控制中心寄生病预防

5、控制所提供。所有血清均置-20℃保存备用。1.2主要试剂1.2.1硝酸纤维素膜（NC，孔径0.25μm），为SchleicherSchuell产品。1.2.2辣根过氧化物酶(HRP)标记的金黄色葡萄球菌A蛋白（HRP-ProteinA；HRP-SPA）由美国进口，工作浓度为1：10000。1.2.3四甲基联苯胺（TMB.2HCL）为Sino-AmericanBiotechnologyCo产品，由上海华美生物工程公司供应。临用前1h配制：先将5mgTMB.2HCL加入1ml二甲亚砜(DMS)液中溶解，然后加入50ml0.05MpH5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，再加入

6、25μl30%H2O2，混匀。1.2.4封闭液为含1%BSA的pH7.0PBS-Tin；再置冰浴中超声粉碎，频率1500Hz，每次3min，间歇1min，共5次。然后置冰箱冷冻室，反复冻融3次；最后于4℃下离心（10000转/min）1h，上清液即为粗抗原。经UV-210紫外分光光度计280/260nm波长测定，计算出各蛋白浓度分别为0.034mg/ml、0.044mg/ml、0.026mg/ml，分装置-20℃备用。1.3.3血吸虫组分抗原的制备（1）取雌、雄虫和虫卵粗抗原各1.5ml，分别沿管壁缓缓加入层析管（纤维素层析柱），使纤维素与抗原物质之间形成界面混匀

7、状态。（2）待粗抗原渗入层析柱后，再用0.0175mol/LpH6.3缓冲液不断滴入层析管，进行洗脱。（3）层析管下端用华氏试管收集洗脱液，每管收集3ml，每种抗原各收集18管。（4）测定3组各管内洗脱液的OD值，分别得出3个峰值；各收集峰值前后OD值较高的2～3管洗脱液混合，即可获得雌、雄虫和虫卵3种纯化组分抗原。通过SDS-PAGE和波长测定，计算出各组分蛋白浓度分别为0.034mg/ml、0.044mg/ml和0.026mg/ml，分装后置-20℃保存备用。1.4快速斑点免疫渗滤试验1.4.1稀释抗原用pH9.60.05mol/L碳酸盐缓冲液分别稀释3种抗原

8、，其中雌、