荧光原位杂交检测宫颈脱落细胞hterc基因实验方

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1、荧光原位杂交检测宫颈脱落细胞hTERC基因实验方【摘要】目的：探讨荧光原位杂交技术检测端粒酶基因(hTERC)实验方法的最佳方案。方法：采集海医附院收治的140例患者的宫颈脱落细胞,分别应用液基取材刷、无菌棉签取材法;生理盐水低渗、TCT低渗、直接取液滴片、TCT直接低渗4种制片方法;水浴和直接消化法;甲酰胺法和共变性法,通过检测宫颈脱落细胞hTERC基因表达成功率,对比实验方法的最佳方案。结果：取材方法中液基取材刷与无菌棉签的细胞数量满意率分别为95.5%、14.3%，2种方法差异有统计学意义(P<0.05);

2、生理盐水低渗、TCT低渗、直接取液滴片、TCT直接低渗4种方法杂交成功率分别是80.0%、84.8%、46.2%、82.1%,其中直接取液滴片与其他法差异有统计学意义(P<0.05),其他方法之间比较差异无统计学意义(P>0.05);2种消化法中水浴和直接法杂交成功率分别为88.9%、94.1%，差异无统计学意义(P>0.05)，杂信号比例分别为16.7%、45.6%，差异有统计学意义(P<0.05);2种变性法中甲酰胺法和共变性法杂交成功率分别为72.3%、96.0%，差异有统计学意义(P&l

3、t;0.05)。结论：荧光原位杂交技术检测宫颈脱落细胞hTERC基因时,以液基取材刷取材细胞数量多，TCT低渗方法制片效果最好，水浴法和共变性杂交成功率最高。【关键词】荧光原位杂交;宫颈脱落细胞;TERC基因[ABSTRACT]Objective:ToinvestigatetheoptimalmethodsoffluorescenceinsituhybridizationonhTERCgenedetection.Methods：140samplesofcervicalexfoliatedcellsplingandase

4、pticcottonsamplingintheAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege;moviesadebyphysiologicalsalineinfiltration,TCTinfiltration,directdroppinganddirectTCTinfiltration.Allexperimentalmethods,bathanddirectdigestion,formamideanddenaturationlaplingmethods,thesatisfactory

5、rateofcellquantityinfluidbasebrushandasepticcottonethodsethod,otherthreemethodsongthem.Intethods,thesuccessrateofhybridizationethods,thesuccessrateplingofquantitycells,TCTinfiltrationispreferableinmakingmovies,bathandhybridizationvariabilityhavehighersuccessrat

6、e.　　[KEYantelomeraseRNAponent,hTERC)的扩增,发现它与宫颈病变有着密切的关系[1]。FISH的原理是以已知的标记单链核酸为探针,按碱基互补原则,与待检材料中未知单链核酸进行结合,形成荧光显微镜下可检测的荧光信号,本实验从取材、制片、消化、变性4个方面,探讨实验方法对FISH杂交率的影响。　　1材料与方法　　1.1材料　　收集2007年11月～2009年3月在海南医学院临床附属医院就诊的140例妇科患者的宫颈脱落细胞标本(排除严重内科疾病及生殖系统炎症)。　　1.2方法　　FISH检测均

7、以细胞学检查和组织病理学结果为参照标准。　　1.2.1取材(1)液基取材刷：患者取膀胱结石位，暴露宫颈，干棉签擦拭分泌物，使用一次性TCT毛刷插入宫颈口,在宫颈外口鳞柱状上皮交界处,以宫颈外口为中心,均匀按顺(逆)时针旋转5周,停留10s左右，将宫颈刷置于TCT液基中保存;(2)无菌棉签：取材方法同前，棉签放于生理盐水中保存。　　1.2.2制片(1)生理盐水低渗：将生理盐水细胞储存液充分震荡10min，放置1～2min后取10mL细胞储存液,1500r/min离心10min,去上清，如细胞少，可再取更多液体。加5mL胶

8、原酶B,37℃水浴30min,间断吹打，离心,加5mL去离子水37℃水浴20min,加入2mL固定液(冰乙酸∶甲醇=1∶3)固定10min,离心后弃上清,吹打悬浮细胞,重复2次固定，取适量密度细胞悬液10μL用移液器滴片。(2)TCT低渗：胶原酶B20min，去离子水40min，其余处理同生理盐水法。(3)直接取液滴片：取10mL