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1、重组Canstatin蛋白联合氟尿嘧啶治疗裸鼠结肠癌移植瘤实验探究【摘要】目的探讨血管生成抑制剂Canstatin与细胞毒药物氟尿嘧啶(5-FU)联合应用治疗结肠癌的效果,以期探索结肠癌治疗新途径。方法结肠癌SW-480细胞(1×107/只)注射到30只裸鼠皮下,建立结肠癌皮下移植瘤模型。当肿瘤长至2~3mm时,随机分6组。给药途径均为腹腔注射给药。治疗期间,定期用圆规和游标卡尺测量皮下移植瘤大小。疗程结束时,取下瘤体,常规病理切片,观察药物毒性反应,CD31免疫组化染色,检测肿瘤内微血管密度(MVD)。
2、结果①各试验组肿瘤的生长明显受到抑制，瘤体质量明显低于对照组(P1．15说明二药合用有协同作用。动物实验结束裸鼠采用颈椎脱臼法处死。�1．5光镜观察及免疫组化无菌条件下取出肿瘤组织,称重,以40g/L甲醛固定。为观察药物毒性反应,同时取出实验动物的心、肝、胃、胰腺、肠等组织以40g/L甲醛固定。免疫组化染色采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶法。镜下微血管计数分级方法参照Wender等[9]的方法，先在低倍光镜下(40倍)确定肿瘤内新生血管最密集区作为“热点”，进行血管计数，然后在高倍镜视野(200倍)计数5
3、个视野，每个视野的血管平均数为该切片的MVD值。�
81．6统计学方法计数资料数据采用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13．0软件，单向方差分析(One-wayANOVA)进行样本均数间多重比较，两两比较用非配对t检验。�2结果�2．1裸鼠体内成瘤情况自接种后第5天，所有裸鼠均可见接种部位小结节，约5mm×5mm大小，随后结节逐渐增大，至第10天，约7mm×7mm。42只裸鼠全部成瘤，成瘤率达100%。�2．2各组药物对裸鼠皮下移植瘤生长的影响试验结束后，各用药组瘤质量及瘤体积明显低于对照组(P0
4、．05),联合治疗组小鼠体质量高于对照组,差异有统计学意义(P<0．05)。各实验组动物心、肝、胃、胰腺、肠等脏器常规病理检查未发现明显异常。�2．4移植瘤组织的病理形态学观察试验结束后，进行移植瘤组织病理学切片，光镜下均可见癌组织，癌细胞圆形或椭圆形，核大，核仁明显,病理分裂核多见，癌细胞被纤维组织分割成大小不等的癌巢，其间可见腺管、腺腔样结构。�2．5免疫组化改变疗程结束时,病理切片经免疫组化染色,以5个高倍视野计算,各试验组MDV分别是:A组36．4±5．6;B组31．2±4．0;C组28．2±3．
5、7;D组25．0±4．8;;E组22．6±3．6;F15．0±2．8。见图2。8�3讨论�长期以来，对于结肠癌的治疗的实验研究,以往主要集中在对肿瘤细胞本身的抑制或杀灭作用的研究,但由于肿瘤细胞的异质性、遗传不稳定性和易产生耐药的特点,目前为止,尚未取得满意效果。自1971年,Folkman[10]首次提出,肿瘤生长依赖于新生血管形成，而后大量研究证实：肿瘤生长经历两个阶段：血管前期和血管期，在肿瘤血管前期，肿瘤细胞主要依赖弥散作用获取营养，当肿瘤生长至1~2mm3、细胞数达到107左右时，其继续生长就必
6、须要由新生血管来提供足够的氧气及营养物质[11]。同时，肿瘤细胞还可通过新生血管向周围组织浸润和远处转移，在继发部位形成转移灶，而转移灶的继续生长和转移仍然需要新生血管[12]。因此针对肿瘤血管的“抗血管生成疗法”近年被广泛应用于这一领域的研究,天然多肽类血管生成抑制剂以其高效、低毒、不易产生耐药等特点成为研究热点。�Canstatin是新近发现的一种内源性血管生成抑制剂,其蛋白的相对分子量约为24KD,它是Ⅳ型胶原α2链NC18区的功能域，最新研究表明：Canstatin作为胶原来源的内源性血管生成抑制
7、因子，可剂量依赖性抑制内皮细胞管结构形成,有效抑制内皮细胞增殖和转移,且能诱导内皮细胞凋亡。其抑制肿瘤生长的效力可能超过内皮抑素[13]。李玉英等其在体外抑制血管内皮细胞增生的半数有效剂量(ED50)是内皮革抑素的1/3[14],显示了其强大的抗血管生成作用。�本研究表明，Canstatin10mg/（kg•d）,腹腔注射,治疗第10天起,肿瘤体积显著低于对照组,第21天时,抑瘤率达52．98%。而治疗期间,整个治疗用药过程中小鼠活动良好,未见脱毛、腹泻等明显毒副作用。而随着Canstatin
8、蛋白浓度的增加，抑瘤率明显增加，由30．02%到52．98%。Canstatin治疗组小鼠体质量与对照组相比差异无统计学意义。免疫组化结果显示,Canstatin治疗组高浓度组小鼠肿瘤内MVD显著低于对照组(P<0．05)；Canstatin低浓度组与对照组差异无统计学意义，考虑可能与剂量相关；联合5-FU+Canstatin低浓度治疗组、联合5-FU+Canstatin高浓度治疗组与对照组浓度组小鼠肿瘤内MVD显著低于对照组
