rhucd40l对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用

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1、rhuCD40L对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用【摘要】目的：通过动物体内实验研究证实rhuCD40L对人结肠癌的治疗作用，从而进一步探讨其抗肿瘤机制。方法：将皮下接种HT-29人结肠癌细胞后建立人结肠癌模型的20只裸鼠随机分为二组，治疗组以rhuCD40L作皮下注射；对照组以生理盐水作皮下注射，定期观察裸鼠的生活状况并测量其体重，治疗5周后处死裸鼠并取瘤，测量两组瘤大小及瘤重，并比较结果。结果：20只裸鼠全部成瘤，实验过程中所有裸鼠生活状况均良好，无一裸鼠死亡；对照组与治疗组之间的瘤大小及瘤重存在差异，差异有统计学意义（P<

2、;0.05）。结论：rhuCD40L对人结肠癌有一定的治疗作用。【关键词】CD40；CD40配体；人工合成三聚体CD40L；裸小鼠；结肠癌CD40L对表达CD40的肿瘤细胞具有广泛的生长调节作用。大量研究表明，CD40L与表达CD40的肿瘤的相互作用可以直接抑制多种肿瘤的生长。结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，在我国近20年来尤其在大城市，发病率和病死率有逐年上升的趋势。目前治疗结肠癌仍以手术切除为首选治疗方法，但由于术后局部复发和转移率较高，术后5年生存率仍较低。当前需要寻求一种更好的辅助治疗手段以提高结肠癌患者生存率。因此，本实验

3、以裸鼠为载体，选用人结肠癌HT-29细胞株建立人结肠癌裸鼠皮下移植模型，旨在研究rhuCD40L的抗肿瘤作用。1材料与方法1.1细胞:HT-29人结肠癌细胞株，由中国科学院上海细胞库提供。1.2实验动物:20只SPF级裸小鼠，4～5周龄，体重16～20克，均为雌性，由中国科学院上海实验动物中心提供。均饲养于苏州大学SPF级实验动物中心。1.3主要试剂和药物:McCoy’5A培养基购自GiBco公司；rhuCD40L购自CaymanChemical公司。1.4细胞培养与传代:以下各项操作均在无菌细胞培养室的超净工作台中进行。人结肠癌H

4、T-29细胞于McCoy’5A培养基（含10%新生牛血清）中维持，置于37℃、5%CO2孵箱内培养，细胞为单层贴壁生长，待贴壁细胞融合达70%～80%时以胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化传代。1.5收集细胞并接种裸小鼠:将处于对数生长期的细胞以胰酶消化后用无血清McCoy’5A培养液稀释成细胞悬液，离心、弃去上清，再以无血清McCoy’5A培养反复洗涤、离心3次，弃上清，以无血清McCoy’5A培养液稀释细胞并调整细胞浓度至3×107/ml；取该细胞悬液0.1ml/只均注射于裸鼠右上肢根部的背部皮下。1.6分组治疗:待肉眼可见裸

5、鼠接种部位有肿瘤长出后，将20只裸鼠随机分成二组，每组10只。A组（对照组）：以生理盐水0.5ul/g/日作肿瘤周围皮下注射，1次/日，3日为一疗程，每周一疗程，共5周；B组（治疗组）：以rhuCD40L0.5ug/g/日作肿瘤周围皮下注射，1次/日，3日为一疗程，每周一疗程，连续治疗5周。1.7分别于治疗后第1、3、7、14、28、35天用游标卡尺测量每个肿瘤大小，并重复测量三次，取平均数，以下述公式计算肿瘤体积：V=ab2π/6a：肿瘤结节的最大直径b：肿瘤结节的横经，末次测量后脱颈处死裸鼠，切除肿瘤称重。治疗期间还要连续观察裸

6、鼠的饮食、大小便、精神、活动与消瘦等情况。1.8统计学方法:所有数据以±s表示,用SPSS15.1统计软件包进行统计学分析，检验水准为0.05。2结果2.1本实验用20只裸鼠均于HT-29人结肠癌细胞皮下接种后4～5d在接种部位出现直径约0.4cm大小的肿瘤结节，成瘤率为100%。所有裸鼠治疗期间均未出现明显的活动减少、食欲减退、恶心、呕吐、反映迟缓、精神萎靡、消瘦等现象。实验结束时无一裸鼠自然死亡。实验中的裸鼠图片见图1。2.2治疗过程中肿瘤生长趋势图见图1（根据治疗过程中所测得的肿瘤体积数据2.3治疗结束后测量肿瘤体积值见表1。

7、分组动物数（n）瘤体积（㎝3）A组102.028±0.047B组100.767±0.007t=77.18,p<0.053讨论CD40是肿瘤坏死因子受体(tumornecrosisfactorreceptor，TNF．R)家族的成员，表达在B淋巴细胞、单核细胞、造血干细胞、树突状细胞(DCs)、内皮细胞、上皮细胞等表面。CD40配体(CD40ligand，CD40L)也称CD154，是肿瘤坏死因子(TNF)家族的成员，主要由活化的CD4+T淋巴细胞表达。CD40L与CD40的相互作用可以直接抑制人的乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、膀胱

8、癌、非小细胞肺癌和鳞状上皮癌等的生长，此作用与CD40L能够诱导肿瘤细胞的细胞周期阻滞和／或凋亡有关。CD40L还能诱导DCs细胞表型和功能的成熟，可以通过上调共刺激因子的表达及细胞因子的分泌来增强上皮性肿瘤的免疫原性。许多模型中都证