氧环境影响关节软骨细胞表型的相关研究

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1、氧环境影响关节软骨细胞表型的相关研究：梁静　邓廉夫　朱雅萍　周琦　魏立【摘要】［目的］观察检测低氧和常氧条件下原代和传代后软骨细胞各特异性基因及蛋白表达的改变。［方法］采用3～5日龄C57BL/6小鼠，取四肢关节软骨，经机械分离和酶消化法获得关节软骨细胞，将原代细胞P0和传代后细胞P1、P2分别在普通和低氧培养箱中培养2d，用RT-PCR检测II型胶原、可聚蛋白聚糖和sox9特异性基因及Ihh、PTHrP、bmp4、inethespecificgeneandproteinexpressionofprimaryandpassagedchondrocytesinnormaloxyge

2、ntensionandhypoxia.［Methods］ArticularchondrocyteslimbjointcartilageofC57BL/6mice(3～5days).Primarychondrocytes(P0)andpassaledchondrocytes(P1,P2)aloxygentensionandhypoxiarespectivelyfortRNAlevelsofcollagenII,aggrecan,sox9,Indianhedgehog(ihh),parathyroidhormone-relatedprotein(PTHrP),bonemorphoge

3、icprotein(BMP)-4andinedinedmunohistochemistryandtoluidinebluestaining.［Results］Duringthecultureofprimarychondrocyte,theexpressionofcollagenIIandaggrecanincreasedunderhypoxia,mRNAlevelsofcollagenII,etime.ThemRNAlevelsofspecialgenesanddifferentiationrelatedgenesofpassagedchondrocytesRNAlevelofC

4、ollagenIIofprimarychondrocyteunderhypoxiaincreased.Itmayberegulatedbychondrocytedifferentiationgeneihh,andedunderhypoxiathroughshort-termmonolayercultureinvitro.　Keyin。在超净台上用眼科剪离断四肢，解剖显微镜下清理髋、膝、肩、肘关节周围皮肤、肌肉和软组织，分离出软骨块，放入盛有DMEM（Gibco，USA）培养基的培养皿中。D-Hanks液冲洗2次，将软骨块剪碎，置入锥形瓶中用5倍体积的0.25%胰蛋白酶（Sigma

5、），37℃预消化半小时，过滤后将软骨块重新置入锥形瓶用0.2%的胶原酶（Sigma）继续消化，待大部分软骨块消失，终止消化。过滤获得细胞悬液，1200r/min离心8min，去上清，无血清培养基洗涤2次，所得细胞沉淀重悬于含10%胎牛血清（JRH，USA）的DMEM中，按2.5×105/ml接种于25cm2培养瓶中，以8×105/ml接种于预置有盖玻片的24孔板中，设3个复孔，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，即P0，每2d换1次液。　　1.2RT-PCR检测软骨细胞特异基因和分化相关基因的表达　　1.2.1细胞标本收集　待5d细胞长满后以相同密度接种传代即P1、P2

6、，并分别将70%～80%融合的P0、P1、P2置于普通培养箱和2%O2（N2平衡）培养箱（Model3110，Thermo）中培养2d。用Trizol裂解沉淀细胞后，抽提RNA。　　1.2.2RT-PCR反应　取RNA2μg，随机引物1μl，加水至12μl，70℃5min置于冰上；5×反应缓冲液4μl，10mMdNTP2μl，RNase抑制剂0.5μl，加水至19μl，25℃5min；逆转录酶（M-MLV）1μl，42℃1h，70℃10min，置于冰上终止反应。按照94℃5min～-94℃30秒，以各基因退火温度30秒，72℃20秒～-72℃7min进行PCR反应，各基因引物见表

7、1。取10μlPCR反应产物行琼脂糖凝胶电泳。用天能凝胶图像处理仪紫外灯下观察并拍照。　　1.3软骨细胞表型鉴定　将不同氧环境下24孔板中的玻片取出，进行II型胶原和蛋白聚糖（Aggrecan）的免疫组化染色及阿利新蓝染色。　　1.3.1II型胶原和Aggrecan的免疫化学染色　培养细胞依次执行下列步骤：吸去培养液，PBS洗2次，10min/次；4%多聚甲醛室温固定15min；3%H2O2离子水孵育10min，消除内源性过氧化酶活性；牛血清白蛋白封闭20min；一抗II型胶原（