永生化髁突软骨细胞软骨表型的特征

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1、万方数据旦壁塑亘盐整壁查!!Q!生蔓l!鲞墨l塑永生化髁突软骨细胞软骨表型的特征STUDYOFTHECHONDROCYTEPHENOTYPEOFIMMORTALIZEDMANDIBULARCoNDYLARCHONDROCYTE段小红，吴军正，刘斌中图分类号：R78文献标识码：B文章墉号：1005—4979{2002)01．071．03体外培养的髁突软骨细胞(mandibularcond)，larchondrocyte，MCC)常表现出不同分化状态的软骨细胞并存，其表型特征也随培养时间而变化，这些不稳定的因素为研究MCC的生物学特性带来了一定的困难。作者通过基因转染的方法将SV4

2、0大T抗原基因导入原代培养的兔髁突软骨细胞，建立了能在体外1年半的时间内稳定传代100次以上的永生化髁突软骨细胞系⋯(immortalizedmandibularcondylarchondrocyte，IMCC)。一些实验表明，永生化的软骨细胞失去了软骨细胞的表型特征，本实验将通过免疫组化方法，观察IMCC有无Ⅱ型胶原和软骨特异的蛋白多糖(proteoglycan，PG)的表达。l材料与方法1．11MCC的建系过程1构建含有SV40大T抗原基因片段的重组逆转录病毒载体，采用脂质体介导的方法，将目的基因转入包装细胞PA317，利用G418筛选阳性克隆，收集并过滤阳性克隆的病毒上清

3、。采用胶原酶和胰蛋白酶消化法原代培养1—2周的新西兰白兔的MCC，通过差异贴壁获得纯化的MCC。用高滴度的病毒上清感染MCC，G418筛选3周后有克隆出现，用滤纸法和有限稀释法挑选克隆，并扩大培养，进行常规的冻存、复苏、传代、以及有关的生物学鉴定。1．2免疫组化检测取第40代和第60代的IMCC以及第3代的MCC作为实验对象。抗体分别是：小鼠抗人I型胶原单克隆抗体(Sigma)、小鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体(NewMarkers)、兔抗牛Ⅱ型胶原多克隆抗体(Chemicon．USA)，小鼠抗兔软骨特异性PG单抗(Chemicon，USA)，免疫组化试剂盒采用Vector公司的免疫

4、组化ABC试剂盒：常规细胞爬片，当细胞长至约80％时，终止培71养。PBS洗2次，丙酮：甲醇(70：30)固定1h；3％H202室温封闭10min，PBS洗2次；10％小牛血清封闭30—60min；1抗(三种抗体效价为l：loo～1：200)40c孵育过夜，同时以PBS替代1抗．作为对照；PBS洗3次，每次10min；生物素标记马抗鼠或马抗兔IgG37℃30min；PBS洗3次，每次10min；ABC复合物37℃30min；PBS洗3次，每次10min；DAB显色5min左右。2结果本实验所用的I型胶原抗体可以识别人、兔、大鼠等的I型胶原蛋白，结果表明IMCCp40和p60，以

5、及MCCp3的细胞胞浆有阳性染色．但MCCp3的阳性细胞较少(见图1)。由于没有合适的抗兔Ⅱ型胶原抗体，所以本实验尝试用抗人和抗牛的Ⅱ型胶原抗体．实验发现，两种细胞在胞浆和胞膜都有阳性染色(见图2)，但使用抗人Ⅱ型胶原抗体的染色结果较差，染色灰度较弱。本实验使用的小鼠抗兔软骨蛋白多糖单克隆抗体，可以特异识别人、牛、兔、狗等种类的关节软骨蛋白多糖的核心蛋白的短肽，IMCCp40和p60，以及MCCp3的细胞胞浆和胞膜都有阳性染色(见图3)。3讨论Ⅱ型胶原是软骨细胞分泌的特异性物质之一，本实验证明，IMCC和MCC同时都有抗Ⅱ型胶原的阳性染色，表明这两种细胞具有软骨表型。软骨特异P

6、G的表达也再次证明了这一点：并且不同代数的IMCC持续表达Ⅱ型胶原和PG说明该细胞系具有稳定的软骨细胞表型。作者单位：第四军医大学口腔医学院(710032，作者简介：段小红(1968)，女，江苏』、．现为西安交通大学材料学院在读博士后万方数据正常成熟的软骨细胞不合成I型胶原，体外单层培养软骨细胞初期，细胞继续台成Ⅱ型胶麒，但传代到4代以后，细胞的形态一方面从多角形或圆形转变成梭形，另一方面，n型胶原的合成减少，I型胶原的表达增多2·3。与从肋骨或关节软骨提取的软骨细胞不同．MCC体外培养的细胞群体不是单一的，包括未分化的间质细胞、幼稚和成熟的软骨细胞、及肥大化的软骨细胞4-“，

7、因此可能有表达Ⅱ型口腔颌面外科杂忐2002年第12卷第1期胶原的成熟的软骨细胞，也有表达I型胶原的幼稚软骨细胞和未分化的软骨细胞，所以有J型胶原和Ⅱ型胶原的同时表达。一些实验表明，大T抗原iJ以引起软骨细胞的永生化，使细胞小再表达Ⅱ型胶原，H表达l型胶原，并且这种变化不能逆转，如Thenet、Bhalerao_^7等的实验结果、但也有不同的报道，文献报道，利用大T抗原的基因片段获得了具有软骨表型的永生万方数据旦墅塑堕丛壁盘查!鲤!生蔓!!鲞筻!塑化细胞株MC615。SV40引起软骨细胞永生化