婴幼儿关节软骨细胞的体外培养和表型研究及逆向诱导分化初探

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1、硕士学位论文论文题目婴幼儿关节软骨细胞的体外培养和表型研究及逆向诱导分化初探研究生姓名徐大鹏指导教师姓名王晓东专业名称儿科学研究方向小儿骨科论文提交日期2013年3月婴幼儿关节软骨细胞的体外培养和表型研究及逆向诱导分化初探中文摘要婴幼儿关节软骨细胞的体外培养和表型研究及逆向诱导分化初探中文摘要一、婴幼儿关节软骨细胞体外培养及其鉴定目的探索体外培养婴幼儿关节软骨细胞的方法，并对其细胞表型进行鉴定，为下一步逆向诱导分化提供细胞。方法取多指患儿指间关节的软骨，经过机械剪切、胰酶、胶原酶的消化获得细胞后，用1640

2、培养基进行体外培养。倒置显微镜观察细胞形态、生长情况，绘制关节软骨细胞生长曲线；透射电子显微镜观察细胞超微结构；Alcianblue染色、蕃红花“O”-亮绿染色检验细胞产生的蛋白聚糖；阿利新兰法检测不同代次细胞蛋白聚糖含量；免疫组织化学染色检测细胞分泌的II型胶原。结果婴幼儿关节软骨细胞贴壁生长。原代细胞生长缓慢，细胞10~15天长满六孔培养板的一孔，进行传代；第1代、2代、3代等细胞生长旺盛，3~5天长满40ml培养瓶的一瓶；细胞在第12代、13代出现凋亡表现。关节软骨细胞的生长曲线呈倒“S”型，透射电子

3、显微镜观察到细胞具有软骨细胞共性。Alcianblue染色阳性，蕃红花“O”-亮绿染色阳性；第1、2、3代关节软骨细胞蛋白聚糖含量逐渐增高，第5、6代后细胞蛋白聚糖含量逐渐减低；免疫组织化学染色证实细胞分泌II型胶原。结论在体外成功建立了婴幼儿关节软骨细胞的培养方法，经多种鉴定证实所培养出的细胞是关节软骨细胞。二、婴幼儿关节软骨细胞采用iPS技术逆向诱导分化的初步研究目的尝试采用iPS技术诱导婴幼儿关节软骨细胞逆向分化为多能分化状态。方法先培养胎鼠肌细胞并用丝裂霉素处理后做滋养层细胞，将体外培养的第1I中文

4、摘要婴幼儿关节软骨细胞的体外培养和表型研究及逆向诱导分化初探代、第2代人关节软骨细胞分别用含4种转录因子的逆转录病毒进行感染，再转至滋养层细胞进行培养。结果第1代或第2代关节软骨细胞经逆向诱导培养一月后，由原来的梭形转变为多边形，呈克隆样生长，但是此后细胞未见生长，逐渐死亡，此实验未进行下去，现在相关研究人员还在不断摸索中。结论采用iPS技术诱导人关节软骨细胞存在一定的技术障碍。关键词：人关节软骨细胞；体外培养；鉴定；iPS；逆向诱导作者：徐大鹏指导老师：王晓东张亚甄允方II婴幼儿关节软骨细胞的体外培养和表

5、型研究及逆向诱导分化初探英文摘要Invitroculture,characterizationandreprogrammingofinfantarticularchondrocytesAbstractPartI:themethodsofculturinginfantarticularchondrocytesinvitroanditsidentificationObjectiveToestablishakindofmethodaboutculturetheinfantarticularchondrocytes

6、invitro,identifythecellularphenotype,andselectecellsforthenextreverse-induceddifferentiation.MethodsThecellsweusedcomefrominterphalangealjointwhichwereexcisedfrompolydactyliachildren.Beforeculturethecells,wecutthemintopieces,usedTrypsinandCollageneseIItodi

7、gestandputtheminto1640culturemedium.CheckupbiologicalcharacteristicsofthecellsbyapplyingthewaysofmicroscopeandTransmissionelectronmicroscopy.IdentifyingthecellsbyapplyingthewaysofHEstaining,Alcianbluestaining,safrarine“o”staining,Immunohistochemicalstainin

8、ganddepictsthegrowthcurveResultsWehaveobservedthatarticularchondrocytesgrowalongthewalls,Theprimarycellsgrowslowly,10daysto15dayslatercoveredoneholeofSix-wellcultureplates.Thefirstgeneration，thesecondgenerati