关节软骨撞击伤后软骨细胞凋亡的实验研究

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1、关节软骨撞击伤后软骨细胞凋亡的实验研究作者：邵世坤，裴福兴，狄东华，赵建忠【摘要】目的］用TUNEL标记法和透射电镜来观察软骨撞击伤后软骨细胞凋亡的演变情况。［方法］56只健康成年新西兰大白兔，随机分高、低能量两组，每组28只，随机选取一侧后肢为实验组，另一侧为对照组；不同重量的击锤撞击股骨内侧髁软骨面致不同的损伤。术后4d，1、2、4、8、16、32周收集标本，每个时间组4只兔子，进行TUNEL标记法和透射电镜来观察软骨细胞的凋亡。［结果］对照组标本中在软骨的中间层和钙化层，出现凋亡细胞。低能量组中，伤后4d，1、2周的标本中，软骨的移形层和过渡层出现凋亡细胞，细胞凋亡率与对照

2、组之间无统计学意义；4周后的标本中凋亡细胞明显减少，细胞凋亡率与对照组之间无统计学意义。高能量组中，伤后4d软骨浅表层和移形层中出现凋亡细胞，而且伤后时间越长凋亡细胞所占比率越大，细胞凋亡率与对照组之间有统计学意义。［结论］软骨高、低能量撞击伤后早期软骨细胞均出现凋亡，凋亡率高于对照组；但低能量伤后4周软骨细胞凋亡率恢复到对照组水平；高能量伤后软骨细胞凋亡率随时间逐渐增高。【关键词】软骨损伤；软骨细胞；凋亡；创伤性骨关节炎　　近来的研究表明，骨关节炎和体外软骨损伤模型中，可观察到软骨细胞的凋亡。随着骨关节炎严重程度加重，软骨细胞的凋亡率也随之增加，机械损伤也能诱导软骨细胞的凋亡，

3、后者可能是软骨细胞对机械损伤的最早反应之一［1,2］。体内关节软骨受到撞击伤后，软骨细胞的凋亡率如何演变人们还缺乏足够的认识。本实验在Nel／kg腹腔注射麻醉，取仰卧位，脱毛，常规消毒铺巾。　　1.2.2膝关节内侧纵形切口，长3cm，依次切开皮肤、皮下组织、深筋膜、关节囊，将髌骨外翻，膝关节屈曲120°，使股骨干与水平面垂直，骨盆固定带固定骨盆，用大腿固定带固定大腿防止撞击时不稳定。　　1.2.3用1.33、0.43kg的击锤分别于46、20cm高处通过导杆自由坠落，产生的能量为6.3J(能造成胶原网架断裂)和0.9J(不能造成胶原网架断裂)［2、3］，再通过撞击体致股骨内侧髁软

4、骨面的损伤。对照侧不行撞击，余步骤同试验组。术毕庆大霉素生理盐水冲洗关节腔，逐层缝合伤口。麻醉清醒后笼内自由活动。术后肌注青霉素20万单位，每日2次，连用3d。　　(4)于术后4d，1、2、4、8、16、32周收集标本，进行TUNEL标记法和透射电镜来观察软骨细胞的凋亡。　　1.3形态学观察　　1.3.1取材、固定　　各组于观察期满后，在相同位置用锋利双面刀片软骨下骨处切取0.5cm×0.4cm×0.2cm的软骨，不取软骨下骨，避免了因标本脱钙过程中破坏细胞造成假阳性。标本切成2等份，1份立即置于10％中性福尔马林溶液中在室温下固定24h后，石蜡包埋组织块，作连续切片，片厚为51

5、μm，制成病理切片备用。另1份备做透射电镜之用。　　1.3.2TUNEL末端标记　　病理切片常规脱蜡，梯度酒精补水后，切片滴加蛋白酶K修复抗原。滴加20％小牛血清和3％小牛血清白蛋白封闭非特异性反应。在DNA片段标记后，用0.3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，室温，15min。切片滴加20％羊血清、3％小牛血清白蛋白及1％封阻剂，37℃，15min，再次封闭非特异性反应。切片滴加1∶2稀释的POD20μl，置湿盒内，37℃，30min进行免疫反应，扩大信号。镜控下，DABH2O2显色。胞核呈深棕色即用自来水流水冲洗终断反应。苏木精复染。梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。　　1

6、.3.3透射电镜　　将标本放入5％戊二醛保存液中浸润保护，用锋利的双面刀片冠状面将软骨切成1mm3小块，立即投入4℃5％戊二醛溶液中固定24h后，0.1mol／L二甲砷酸钠缓冲液(pH7.35)漂洗24h。1％锇酸后固定2h，乙醇逐级脱水后环氧树脂包埋，超薄切片机70nm超薄切片，经醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，HITACHI600透射电镜观察，拍片。　　1.4图像分析　　每1张TUNEL标记切片显微摄像镜下(放大10×40)，随机选取4处视野，将图像捕获入计算机，形成后缀名为JPEG的彩色数码图像。在MIOS2000图像分析仪内做图像分析，采用目标计数，测定软骨细胞凋亡率，

7、算术平均后得到每张切片的细胞凋亡率。　　1.5统计学处理　　用SPSS12.0统计软件包，按高、低能量组与相应对照组分别进行两两比较，采用t检验，取95％可信区间，观察各实验组与对照组的软骨细胞凋亡率有无统计学差异。　　2结果　　术后所有实验动物均存活至预定取材时间，切口愈合好，无1例感染。　　2.1TUNEL标记法软骨细胞凋亡率的观测　　软骨细胞核呈橙黄色的为凋亡细胞，蓝色的为正常细胞。对照组标本中在软骨的中间层和钙化层，出现凋亡细胞。低能量组中，伤后4d，1、2周的标本中，软