关节软骨急性损伤后软骨细胞凋亡的实验研究

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1、关节软骨急性损伤后软骨细胞凋亡的实验研究作者：宋长志，杨淮海，董启榕【摘要】目的探讨关节软骨急性损伤后软骨细胞的凋亡特点。方法利用钻头钻孔造成兔膝关节软骨损伤，利用脱氧核糖核苷酸末端转酶介导的生物素脱氧尿嘧啶苷酸缺口末端标记法、透射电镜、流式细胞仪等方法对受损软骨进行检测。结果损伤后软骨细胞出现坏死和凋亡，损伤后第4天软骨细胞凋亡率最大，凋亡细胞全层分布，主要分布在浅表层和中间层。结论关节软骨损伤后软骨细胞发生凋亡，4d达高峰，以后逐渐减少。提示关节软骨急性损伤后，早期抑制软骨细胞的凋亡对防治骨关节炎可

2、能有十分积极的意义。【关键词】软骨；急性损伤；凋亡　　ExperimentalStudyonChondrocyteApoptosisFolloissionelectionmicroscopy(TEM)，fluorescenceactivatedcellsorter(FACS)oralcondylesobtainedatdifferentintervalsfolloensdisplayedstatisticallysignificantincreasedoveralllevelofapoptosis，m

3、ostofapoptoticchondrocytesiddlezone.ConclusionChondrocyteapoptosismaycontributetothesubsequentdevelopmentofposttraumaticarthritis.Itportanttopreventthekneefromposttraumaticarthritisbyrepressingchondrocyteapoptosisasearlyaspossible.Keymedcelldeath，PCD)，

4、特点是胞体缩小、DNA片断、出现凋亡小体以及炎症反应。细胞凋亡发生在对机械和热损伤、毒素、细胞因子、病毒和细菌等因素的应答中［1］。Kim等［2］的研究表明，软骨细胞的凋亡可能会导致创伤后骨关节炎的发生。软骨损伤后的病理改变及其引起创伤性关节炎发生的机制还不清楚，本实验通过对兔膝关节急性损伤模型的观察，探讨软骨急性损伤后细胞死亡的方式以及与骨关节炎发生之间的关系。　　1材料与方法　　1.1动物模型的制作　　选用新西兰大白兔，重2.5～3.0kg。2％戊巴比妥钠静脉麻醉，双侧膝关节局部剪毛。参照Costo

5、uros等［3］介绍的方法，用2.0mm直径的钻头钻孔造模。兔取仰卧位，四肢固定，膝关节屈曲。常规碘伏消毒，髌韧带内侧切口，过屈膝关节显露股骨内外髁承重面，用直径2.0mm的钻头在股骨内外髁承重面钻孔，钻透全部软骨直至软骨下骨，深度2～3mm，造成膝关节软骨机械性损伤。钻孔后，冲洗关节腔后逐层缝合，苏醒后分笼饲养，自由活动。　　1.2动物分组　　选用新西兰大白兔28只，体重2.5～3.0kg。随机选择一侧膝关节造模，对侧作为对照。选择术后第0、2、4、7、10、14天和4周为观察时间点，并据此随机分为7

6、组，即0d(4只)、2d(4只)、4d(4只)、7d(4只)、10d(4只)、14d(4只)、4周(4只)。另外再取新西兰大白兔20只，16只双侧膝关节钻孔造模致软骨损伤，作为损伤组，4只作为正常组(兔膝关节软骨细胞本身数目较少，一个损伤部位分离的细胞数不能满足流式细胞仪检测的要求。因此实验中双侧同样标准造模，将每只兔两侧股骨内外髁受损区分离的软骨细胞合在一起进行流式细胞计数检测)，用于流式细胞仪检测。　　1.3标本的采取　　术后各时间点空气栓塞处死动物快速采取标本。切取股骨内外髁钻孔区周围直径为3～4

7、mm全层软骨。各时间点标本经石蜡包埋切片，用于脱氧核糖核苷酸末端转酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(terminaldeoxynucleotidetransferasemediateddeoxyuridinebiotinnickendlabeling，TUNEL)观察。第4天的标本同时切取小部分用于电镜观察。用于流式细胞仪检测的兔于术后第2、4、14天和4周空气栓塞处死(每点4只兔)，无菌操作下切取受损的软骨，宽约2～3mm，置于离心管中，磷酸盐缓冲液冲洗，2000γ/min离心10mi

8、n去除上清液，0.25％的胰蛋白酶消化30min，2000γ/min离心10min去除上清液，0.2％Ⅱ型胶原酶，在37℃恒温培养箱内消化，每隔1h吹打1次，4～6h软骨碎片完全溶解，再经过滤、漂洗、计数制成细胞悬液(大于1×106/mL)，用于流式细胞计数检测。　　1.4透射电镜观察软骨细胞超微结构变化　　取术后第4天的受损软骨及对照侧正常软骨标本各2份。放入2％的戊二醛磷酸缓冲液中，置4℃冰箱48h作前固定，将标本修整成宽约为1.0mm