四物汤对小鼠血清促红细胞生成素及其基因表达影响的实验研究

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1、四物汤对小鼠血清促红细胞生成素及其基因表达影响的实验研究范启兰，许春鹃，甘祝军【摘要】　　目的探讨四物汤对环磷酰胺所致贫血小鼠血清促红细胞生成素（EPO）及肾EPOmRNA表达的影响。方法用环磷酰胺腹腔注射建立小鼠贫血模型，同时给小鼠灌服四物汤，ELISA方法检测小鼠血清EPO的含量；Trizol试剂提取肾组织总RNA，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测肾组织EPOmRNA表达情况（β-actin为内对照标准）。结果四物汤能显著升高小鼠血清EPO水平，明显促进肾组织EPOmRNA的表达。结论四物汤能抑制环磷酰胺所致的小鼠贫血，其作用机制可能是通过促

2、进肾组织EPOmRNA的表达，使肾脏合成EPO增多，从而促进红系细胞生长。【关键词】四物汤；促红细胞生成素；基因表达　　Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofSiRNAexpressionofAnemiainducedbycyclophamideinmice.MethodsAnemiaideinmice,andSiinistered.SerumEPOleveleasuredbyELISA.TotalRNARNAexpressionofEPOinmousekidneyeasuredbyRT-PCR(β-acting

3、eneasacontrol).ResultsSiEPOlevelandpromotethemRNAexpressionofEPOinkidney.ConclusionSiide-inducedanemiainmiceandthemechanismmayberelatedtoincreasingEPOproductionbypromotingthemRNAexpressionofEPOinkidney,andstimulatingthegroide,CY）腹腔注射建立小鼠贫血模型，拟考察四物汤对小鼠血清促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）及肾

4、脏EPOmRNA表达的影响，从分子水平探讨四物汤补血作用的机理。　　1材料与仪器　　1.1动物昆明种小鼠，6～8周龄，体重20～25g，雌雄不限，由赣南医学院实验动物中心提供。　　1.2四物汤的组成及煎制四物汤由熟地、当归、白芍、川芎组成，购于本院附属医院中药房。按《太平惠民和剂局方》规定的剂量称取，熟地15g，当归10g，白芍10g，川芎6g，共计41g/d。按《中药药理研究方法学》〔1〕计算小鼠的等效剂量为10g/(kg·d)。传统方法煎制两次，合并后过滤、浓缩，配制成1∶1的药液（即每毫升药液含生药1g），置4℃保存备用。　　1.3仪器及试剂TGL-1

5、6G型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；全自动PCR扩增仪（2700型，美国AppliedBiosystems公司）；电泳仪（北京六一仪器厂）；紫外分光光度计（2100型，美国AmershamBiosciences公司）；凝胶数字成像系统（法国EEB公司）；环磷酰胺（江苏恒瑞医药公司，批号03041521），Trizol试剂、Oligo(dT)16、TaqDNA聚合酶和dNTP（上海生工）、M-MuLV反转录酶和50bpDNAMarker（MBI）、EPO检测试剂盒（德国BM公司），其余试剂均为国产分析纯。　　2方法　　2.1动物模型的建立小鼠常规饲养数

6、天适应环境后，按小鼠体重100mg/kg于给药第1天用CY腹腔注射1次，造成贫血模型〔1〕。　　2.2动物分组及给药方法30只昆明种小鼠随机分成3组，每组10只，分别为正常对照组（对照组）、CY组、CY+药物组（药物组），灌胃给药。药物组给予四物汤，对照组与CY组给予等体积蒸馏水，连续7d。　　2.3血清EPO的测定小鼠眼眶取血，按常规方法分离收集血清，采用ELISA方法测定血清EPO含量（严格按试剂盒说明书操作）。　　2.4肾脏总RNA的提取断颈处死小鼠后取肾，取100mg肾组织用1mlTrizol试剂提取总RNA（按说明书操作），1％琼脂糖-甲醛变性凝胶

7、电泳及用紫外分光光度计测定OD260/OD280比值鉴定RNA质量。　　2.5反转录（RT）取总RNA1μg，Oligo(dT)160.5μg在70℃变性5min后，依次加入5×反转录缓冲液4μl，10mM4dNTP2μl，RNA酶抑制剂20U，混匀后置37℃5min，再加入M-MuLV反转录酶200U，总反应体积20μl，混匀后置42℃反应60min，然后于70℃加热10min，终止反应。　　2.6聚合酶链反应（PCR）小鼠EPOcDNA引物与β-肌动蛋白（β-actin）引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。EPOcDNA引物序列为：5'-CTCT

8、GGGCCTCCCAGTC-3'和5'-TGTTCG