脂多糖对脐血cd34+细胞体外增殖的影响

《脂多糖对脐血cd34+细胞体外增殖的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、脂多糖对脐血CD34+细胞体外增殖的影响【关键词】胎血;干细胞;细胞增殖;脂多糖类　　[ABSTRACT]Objective:Tostudytheeffectoflipopolysaccharide(LPS)oncordbloodhematopoieticstem/progenitorcellsproliferationinvitro,andexploretheneadelipopolysaccharideandstandardlipopolysaccharideatdifferentconcentrationsresp

2、ectively,thecordbloodhematopoieticstem/progenitorcellsadelipopolysaccharideandstandardlipopolysaccharideatdifferentconcentrationscouldpromoteproliferationofcordbloodCD34+cellsinLPSatloLand10mg/Lrespectively.Conclusion:Lipopolysaccharidemayplayaroleinregulatingthe

3、cordbloodhematopoieticstem/progenitorcellsproliferationinvitro.　　[KEYCO15A日本)、医用净化工作台(J875DA苏州净化设备公司)、台式低速离心机(LD52A北京医用离心机厂)、倒置相差显微镜(OLYMPUSIMTI日本)、EPICSXL型流式细胞分析技术(COI1640(Gibco公司)、淋巴细胞分离液(1.077g/mL,上海试剂二厂)、新生小牛血清(杭州四季青)、四甲基偶氮唑(MTT)(Sigma,U.S.A)、标准脂多糖(Sigma,U.

4、S.A)、自制脂多糖(由本院李延平教授自制)。　　1.3方法和步骤　　1.3.1脐血CD34+细胞的分选(1)脐血单个核细胞的分离：加入2倍RPMI1640培养液稀释脐血，室温轻摇10min充分混匀，按1∶1的比例将稀释后的脐血液沿管壁缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管上层，小心不要混匀;小心收集界面层的单个核细胞，加入PBS中，20℃1200r/min离心15min洗涤2次;沉淀细胞团加入3mLRPMI1640培养基，充分混匀后计数细胞数和台盼蓝拒染细胞活力检查;在3min内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。镜下活细胞

5、拒染，死细胞被染成蓝色。　　(2)脐血单个核细胞的CD34+细胞的分选：应用德国美天旎生物技术公司的磁分选器和单克隆抗体免疫磁珠(阳性)分选法进行提取。　　1.3.2观察脂多糖对脐血CD34+细胞体外增殖的影响(1)脐血CD34+细胞接种:配制含脐血CD34+细胞的溶液,参照文献[2]液体培养体系为RPMI1640含终浓度为20%FBS,BSA(10g/L),GMCSF(10μg/L),SCF10μg/L,IL310μg/L，脐血CD34+细胞终浓度1×105/mL，50μL/孔，种入96孔培养板，每组平行3孔，重复2板

6、。　　(2)脂多糖刺激:按50μL/孔，终浓度分别为0U/mL,0.1U/mL,0.3U/mL,1.0U/mL,3.0U/mL,10U/mL,30U/mL的自制脂多糖及终浓度分别为0mg/L,0.1mg/L,0.3mg/L,1.0mg/L,3.0mg/L,10mg/L,30mg/L标准脂多糖，分别加入50μL/孔上述溶液中。　　1.3.3脐血CD34+细胞活力检测各孔样本混匀，行台盼蓝排斥实验,活性细胞计算公式为:活细胞率(%)=活细胞总数×100%/(活细胞总数+死细胞总数)　　1.3.4MTT试验检测参照文献[2，3]进

7、行,细胞接种于96孔培养板后，37℃、5%CO2孵箱中培养3d，每孔加入MTT(5g/L)20μL,继续培养4h,离心吸弃培养基，加入DMSO100μL，于微量振荡器上振荡20min，待紫色结晶完全溶解后，用M550型ELISAREADER酶标仪测定各组细胞的A570吸光值,以0μmol/L为对照组计算脂多糖作用下脐血CD34+细胞增殖率(ER)。增殖率(ER)=(用药组A值/对照组A值1)×100%。计算最佳效应浓度。　1.3.3实验分组对照组、自制脂多糖组和标准脂多糖组,重复1.3.2下(1)步骤,自制脂多糖组加入终浓

8、度为最佳效应浓度的自制脂多糖,标准脂多糖组则加入终浓度为最佳效应浓度的标准脂多糖,对照组不加脂多糖，重复1.3.3及1.3.4步骤，每组平行3孔，重复2板，计算脂多糖作用下脐血CD34+细胞的MTT值。　　1.4统计学处理　　用SPSS软件分析进行方差分析，P<0.05表示差异有显著