携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门菌促血管形成的实验分析

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1、携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门菌促血管形成的实验分析　　血管发生或新生在胚胎器官的发育、出生后创面伤口愈合及多种病理情况下都起着非常关键的作用。近年来研究表明，生长因子在细胞的增殖、迁移、损伤修复、溃疡愈合及免疫调节等方面起重要作用，已有研究表明，肝细胞生长因子(hepatocytegrop;D公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自美国SantaCruzBiotechnology公司;孵育第13天的鸡胚购自中国农业科学院畜牧研究所;M450甲基纤维素购自美国Sigma公司;Multiporator4308型电转仪购自德国

2、Eppendorf公司。　　1.2方法　　1.2.1携带HGF基因减毒沙门菌菌株的构建　　1.2.1.1携带人HGF基因的真核表达载体　　pcK-HGF的构建按人HGFcDNA序列设计引物，正向引物序列为5'ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc3'，反向引物序列为5'tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt3'。从人胎盘cDNA文库克隆人HGFcDNA(约2.2kb)。并将HGF基因的PCR产物克隆至pSK载体的BamHI和SalI酶切位点

3、中，命名为pSK-HGF。将pcDNA3载体用SspI及AvrII双酶切，回收大片段(约4.9kb)，pEGFP-N1用AvrII酶切，回收小片段(卡那霉素基因，1.1kb)，用T4DNA连接酶将回收的大小片段连接，获得卡那霉素抗性的pcDNA3载体，以避免患者青霉素过敏，命名为pcK。分别用BamHI和ApaI双酶切pcK及pSK-HGF，回收大片段及小片段，用T4DNA连接酶连接，获得携带人HGF基因的含卡那霉素抗性基因的真核表达载体，命名为pcK-HGF。　　1.2.1.2真核表达质粒pcK-HGF电穿孔转化减毒沙门菌将

4、减毒沙门菌Ty21a接种于LB培养液，振荡培养至对数生长中期，低温4000r/min离心收集菌体，用预冷的无菌去离子水洗涤细胞2次后重悬。用电转仪将pcK-HGF和pcK质粒各0.2μg转入200μl预处理的Ty21a。37℃轻柔振荡培养45min后涂布于含卡那霉素(100mg/L)固体LB培养基平皿继续培养，次日挑取菌落进行鉴定。　　1.2.1.3阳性工程菌的筛选从培养板挑取单菌落分别接种于含卡那霉素LB培养液中，37℃振摇培养。转入pcK-HGF的减毒沙门菌阳性菌株的筛选通过卡那霉素抗性、PCR(利用菌液为模板

5、，扩增真核表达启动子CMV及目的基因HGF)及提取质粒后BamHI/ApaI双酶切鉴定;转入pcK的减毒沙门菌菌株的筛选通过卡那霉素抗性及PCR筛选(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV)。CMV扩增引物：5'cccagtacatgaccttatggg3'，5'ggagacttggaaatccccgt3'。HGF扩增引物：5'ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc3'，5'tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt3

6、'。　　1.2.2重组减毒沙门菌活性观察　　1.2.2.1重组减毒沙门菌转染HUVEC将HUVEC接种于6孔细胞培养板中，每孔6105个细胞，次日用无抗生素DMEM培养液洗涤细胞2次，分别将1108cfu携带pcK和携带pcK-HGF质粒的减毒沙门菌加入HUVEC细胞中，37℃共孵育30min，用含庆大霉素(50mg/L)的无血清培养基洗涤细胞后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃孵育4h后加入四环素至终浓度为10mg/L，继续培养48h收集细胞上清，用双抗夹心ELISA法检测上清中HGF的表达水平。一抗为抗人

7、HGF单克隆抗体(1mg/ml)，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，用新鲜配制的OPD底物显色液显色，同时用重组人HGF标准蛋白作标准曲线，以计算上清中HGF的表达量。　　1.2.2.2HGF表达上清对HUVEC的作用分析采用MTT法测定细胞增殖活性。将HUVEC接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞数5103个。12h后吸弃原培养液，每孔加入100ml无血清DMEM，HGF表达上清所加的量分别含HGF100、200、400、800、1600pg。72h后每孔加入20mlMTT，37℃孵育4h后，弃上清，用DMSO溶解沉淀，

8、测其在560nm波长处吸光度(A)。　　1.2.2.3HGF表达上清对鸡胚绒膜尿囊膜血管刺激作用观察采用我们前期报道的实验方法制备甲基纤维素碟。实验分三组：转染携带pcK-HGF质粒的减毒沙门菌的HUVEC细胞上清组(HGF表达产物800pg)、转染携带pcK质粒的减毒沙门菌