姜黄素对人食管癌ec9706细胞凋亡的影响机制论文

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1、姜黄素对人食管癌Ec9706细胞凋亡的影响机制论文【摘要】目的：观察姜黄素（curcumin）对人食管癌Ec9706细胞凋亡作用及凋亡抑制蛋白livin，促凋亡蛋白Smac和caspase3蛋白表达的影响，探索其分子机制.方法:应用40~160μmol/L姜黄素处理Ec9706细胞12~48h后，采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测细胞增殖抑制率；流式细胞术（FCM)检测Ec9706细胞凋亡率：免疫蛋白印迹技术(SO)溶解配成储存液,-20℃避光保存，使用时以RPMI1640完全培养基稀释至所需浓度,使DMSO终浓度

2、10g/L.caspase3鼠抗人mAb购自北京中山公司，livin兔抗人多克隆抗体购自美国Abcam公司，Smac鼠抗人mAb购自美国SantaCruz公司，噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司，其余试剂均为国产分析纯.人食管癌Ec9706细胞株由中国医学科学院肿瘤研究所提供，本实验室传代培养.Ec9706细胞在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基37℃,50mL/LCO2培养箱中培养.待细胞进入对数生长期后用于实验.1.2方法1.2.1细胞增殖抑制试验取对数生长期Ec9706细胞经胰酶消化后，调整细胞密

3、度为1×107/L，每孔200μL接种于96孔板，培养24h后吸去培养液，加入新的培养液，分别设阴性对照组、溶剂（DMSO浓度为10g/L）对照组和不同浓度（40，80，120，160μmol/L）姜黄素组，每组设10个复孔.分别培养12，24，48h，培养结束前4h每项孔加入5mg/LMTT20μL，37℃继续孵育4h（药物继续作用），吸去培养液，每孔加入DMSO150μL，在振荡器上振荡15min，用全自动酶标仪（测定波长490nm）测定各孔A值，实验重复3次，取平均值.根据A值计算细胞生长抑制率（%）=（A对照-A实验

4、）/A对照×100%，并计算IC50值以及相关系数（r）.1.2.2细胞凋亡的检测收集经（40，80，120，160μmol/L）姜黄素作用12，24，48h的Ec9706细胞及对照组细胞，冷PBS漂洗.预冷700mL/L乙醇4℃，固定，上机检测前离心去固定液，5g/L胃蛋白酶消化，碘化丙锭（50mg/Lpropidiumiodide，PI∶10g/LtrintonX-100）室温避光染色.流式细胞仪上机检测，应用软件进行分析.1.2.3livin，Smac和caspase3蛋白表达的检测不同浓度（0，40，80，120

5、，160μmol/L）姜黄素作用Ec9706细胞48h后,收集细胞并用PBS洗涤3次,加入适量的RIPA裂解液冰浴中裂解细胞,收集蛋白,考马斯亮蓝法蛋白定量,取总蛋白相等的样品行90g/LSDSPAGE电泳,然后电转移至PVDF膜上,50g/L脱脂牛奶封闭后加入第1抗体于室温孵育2h,.freelin,加入第2抗体于室温孵育2h,再用TTBS缓冲液洗涤3次，每次10min,加入发光试剂(ECL)显色,以βactin作内参照,用图像分析软件BandScan进行吸光度积分值分析.统计学处理：数据用x±s表示，采用SPSS1

6、1.5统计软件包进行单因素方差分析.两两比较采用t检验.2结果2.1细胞增殖抑制试验姜黄素对Ec9706细胞有生长抑制作用，并呈现时效和量效依赖关系，高浓度组的抑制作用随着时间的积累要大于低浓度组，溶剂对药物作用没有明显影响（P0.05）.当应用160μmol/L姜黄素处理Ec9706细胞48h后，其增殖抑制率达到73.2%，显示出较强的增殖抑制作用.姜黄素作用12h的IC50为216μmol/L(r=0.9371，P0.01)，作用24h的IC50为148μmol/L(r=0.9529，P0.01)，作用48h的IC5

7、0为113μmol/L(r=0.9618，P0.01)．对细胞的生长均起到抑制作用（表1）.表1姜黄素对Ec9706细胞的增殖抑制作用2.2细胞凋亡分析姜黄素能诱导Ec9706细胞发生凋亡，在DNA组方图上表现为G0/G1峰前出现代表细胞凋亡的亚G1峰．对亚G1峰进行定量分析，计算出细胞凋亡率．姜黄素作用后，凋亡率随浓度的增高和时间的延长而明显升高，有明显的量效和时效依赖关系（P0.01，表2）.2.3基因蛋白的表达用0，40，80，120和160μmol/L姜黄素对Ec9706细胞作用48h后，livin蛋白表达水平

8、降低(P0.01)，Smac，caspase3蛋白表达水平增高(P0.01).而且随着药物浓度的增高，有明显的量效依赖关系（图1）.表2姜黄素作用后Ec9706细胞的凋亡率3讨论姜黄素具有广泛的药理作用,尤其作为一种具有良好发展前景的抗癌药物,具有抗癌谱广和毒副作用小的优点,其抗肿瘤作