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《壁虎醇提物对人食管癌细胞ec9706增殖及凋亡蛋白表达的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、壁虎醇提物对人食管癌细胞EC9706增殖及凋亡蛋白表达的影响：王晓兰王建刚宋佳玉李瑞芳【摘要】目的研究壁虎醇提物对人食管鳞癌细胞株EC9706的生长抑制作用及其机制。方法通过MTT法检测不同浓度、不同时间壁虎醇提物对人食管鳞癌细胞的生长抑制作用;倒置显微镜观察不同浓度壁虎醇提物作用细胞24h后细胞形态的改变;吉姆萨染色后光学显微镜下观察细胞凋亡的形态改变;SP免疫组化法检测细胞内凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达。结果6～8mg/ml壁虎醇提物作用于细胞24，48，72h后能够明显抑制EC9706食管鳞癌细胞株的生长(P<0.01,与阴性对照比
2、较)，抑制率分别为13%～76%,37%～88%,54%～93%,抑制作用呈剂量和时间依赖性;Geimsa染色可见凋亡细胞;免疫组化结果显示,壁虎醇提物(6,7mg/ml)处理细胞24h后，与阴性对照组比较，细胞内Bcl-2蛋白无明显变化，而Bax蛋白表达升高，Bax/Bcl-2比值升高。结论壁虎醇提物能够抑制EC9706细胞的增殖并诱导其凋亡，其作用机制可能与凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值升高有关。【关键词】中药壁虎;醇提物;食管癌细胞;凋亡蛋白壁虎又名蝎虎、天龙、守宫，是我国传统的治疗肿瘤的中药材，《四川中药志》关于壁虎的功效有“驱风，破血
3、积包快，治肿瘤”的记录，大量临床和基础研究显示壁虎确有抗肿瘤作用[1,2]。我们前期工作研究表明干壁虎粉可以抑制食管癌细胞的生长增殖，抑制小鼠S180肉瘤的增殖，初步探讨其抗肿瘤作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡，下调VEGF、bFGF蛋白表达有关[3～5]。本实验研究了干壁虎的醇提物对人食管鳞癌EC9706细胞的增殖和凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达的影响，为中药壁虎抗肿瘤作用提供实验依据。 1器材 1.1药品中药壁虎(安徽省亳州市永刚饮片有限公司)，批号：090301。 1.2细胞EC9706食管癌细胞株，由郑州大学医学院王立东教授实验室惠赠。
4、 1.3试剂丝裂霉素C(浙江海正药业股份有限公司，批号：H33020786);胎牛血清(Gibco公司);胰酶(Sigma公司);RPMI-1640干粉(Gibco公司);MTT粉剂(Sigma公司);二甲基亚砜(天津市化学制剂厂);鼠抗人Bcl-2单克隆抗体、鼠抗人Bax单克隆抗体、S-P免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(购自福州迈新生物技术公司)。 1.4仪器二氧化碳培养箱(日本SANYO公司);倒置显微镜XSZ-D2型(重庆光学仪器厂);超净工作台SP-DJ-2B型(浙江省金沄市荣华仪器制造有限公司);ZS-板式酶标仪(中科院生物物理所制
5、造);86-3型超声仪(上海超声波仪器厂);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器公司);冷冻干燥仪(德国MARTINCHRIST公司);96、6孔培养板为美国Costar公司产品。 2方法 2.1药物提取及配制 2.1.1壁虎醇提物的提取取干壁虎1000g粉碎，加入一定体积预冷的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)浸泡过夜后超声30min，超低温离心机离心(8500r/min,20min)，取上清，加入无水乙醇使其终浓度为55%,4℃放置并搅拌(每30分钟搅拌1次)，4h后离心(8500r/min,20min)，取上清，真空旋转蒸发(55℃)回收乙醇
6、，浓缩液冷冻干燥得到壁虎醇提物，-20℃保存待用。以上操作均4℃条件下进行。 2.1.2药物配制将壁虎醇提物以RPMI1640完全培养液配置8mg/ml母液，0.22μm微孔滤膜过滤,母液稀释得7.5，7，6.5，6，5.5mg/ml供实验用,以上药物均实验前新鲜配用。 2.2MTT法[6]测定药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用EC9706细胞株生长于含10%胎牛血清的1640完全培养液中,37℃恒温,5%CO2，95%饱和湿度二氧化碳培养箱中生长。取对数生长期的EC9706细胞，用0.25%胰酶消化细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×104/ml
7、接种于96孔培养板，每孔100μl，实验分3组，即实验组、阴性对照组、阳性对照组，每组设5个复孔并设空白调零孔。将接种EC9706细胞的培养板置于37℃,5%CO2,95%湿度的培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃去原有的培养液,实验组分别加入各200μl的6种不同浓度壁虎醇提物,阴性对照组加200μl培养液,阳性对照孔组加终浓度为20μg/ml丝裂霉素C200μl,混匀后置于培养箱中分别培养24,48,72h后取出培养板，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的MTT,继续培养4h终止培养,吸去孔内上清液，每孔加入二甲基亚砜150μl,置37℃摇床中
8、10min,使结晶物充分溶解后在酶联检测仪于490nm波长处测定各孔光密度值(OD值),并按下式计算抑制食管癌细胞的百分率
