REGIα CDNA 过表达质粒的构建及对胃癌细胞增殖凋亡的影响

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1、第３９卷第５期浙江大学学报（医学版）Ｖｏｌ３９Ｎｏ５２０１０年ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＺＨＥＪＩＡＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＭＥＤＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥＳ）２０１０ｈｔｔｐ：∥ｗｗｗ．ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｚｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｍｅｄＤＯＩ：１０．３７８５／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８９２９２．２０１０．０５．０１０ＲｅｇＩαｃＤＮＡ过表达质粒的构建及对胃癌细胞增殖凋亡的影响１１２１周群燕，陆晓凤，王良静，姒健敏（１．浙江大学邵逸夫临床医学研究所胃肠病实验室，浙江杭州３１００１６；２．浙江大学医学院附属第二医院消化内科，浙江杭州３１０００９）［摘要

2、］目的：构建再生蛋白Ｉα（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｇｅｎｅＩα，ＲｅｇＩα）的ｃＤＮＡ过表达质粒表达载体，在体外评价其对胃癌细胞株增殖及其凋亡的影响。方法：根据ＲｅｇＩαｃＤＮＡ的全序列设计引物，用ＲＴＰＣＲ的方法从胃黏膜组织的总ＲＮＡ中获取ＲｅｇＩα的ｃＤＮＡ编码区域的全序列，经测序其与目的基因序列一致。将获取的ＲｅｇＩα序列经ＴＡ克隆和亚克隆至ｐＩＲＥＳ２ＥＧＦＰ真核表达质粒载体中；将构建的ＲｅｇＩα过表达质粒载体ｐＩＲＥＳ２ＲｅｇＩαＥＧＦＰ转染胃癌细胞株ＭＫＮ２８，并用空载体ｐＩＲＥＳ２ＥＧＦＰ作为对照，利用Ｇ４１８

3、筛选稳定表达ｐＩＲＥＳ２ＲｅｇＩαＥＧＦＰ的ＭＫＮ２８细胞株。通过ＲＴＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测转染后细胞ＲｅｇＩα在ｍＲＮＡ及蛋白质水平的表达；ＭＴＴ法和流式细胞仪分别检测ＲｅｇＩα过表达后ＭＫＮ２８细胞增殖及拮抗Ｈ２Ｏ２诱导凋亡的变化。结果：成功构建ＲｅｇＩαｃＤＮＡ的全序列表达质粒。ＲＴＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测显示：转染ｐＩＲＥＳ２ＥＧＦＰ质粒的ＭＫＮ２８细胞ＲｅｇＩαｍＲＮＡ及蛋白表达水平明显升高（Ｐ＜０．０５）；ＭＴＴ试验显示：转染后细胞增殖能力明显升高（Ｐ＜００５），而且拮抗Ｈ２Ｏ２凋亡的能力

4、增强（Ｐ＜０．０５）。结论：ＲｅｇＩα的过表达能明显增强胃癌细胞ＭＫＮ２８的增殖和拮抗Ｈ２Ｏ２诱导凋亡的能力。［关键词］胃肿瘤；再生／遗传学；细胞系，肿瘤；逆转录聚合酶链反应；遗传载体；质粒；细胞凋亡；细胞增殖；转染［中图分类号］Ｑ７８［文献标志码］Ａ［文章编号］１００８９２９２（２０１０）０５０４９９０７ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＲｅｇＩαｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ１１２１ＺＨＯＵＱｕｎｙａ

5、ｎＬＵＸｉａｏｆｅｎｇ，ＷＡＮＧＬｉａｎｇｊｉｎｇ，ＳＩＪｉａｎｍｉｎ（１．ＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｌｉｎｉｃＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，ＳｉｒＲｕｎＲｕｎＳｈａｗＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００１６，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ＴｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖ

6、ｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１０００９，Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔＲｅｇＩαｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒａｎｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＲｅｇＩαｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒＭＫＮ２８ｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＦｕｌｌｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＲｅｇＩαｃＤＮＡｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｎｏｒｍａｌｇａｓｔｒｉｃｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓｂｙＲＴＰＣＲａｎｄｃｌｏｎｅｄｉｎｔ

7、ｏｐＩＲＥＳ２ＥＧＦＰｖｅｃｔｏｒ．ＲＴＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＲｅｇＩαｉｎＭＫＮ２８ｃｅｌｌｓ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＲｅｇＩαｏｎｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＭＴＴａｓｓａｙａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｗａｓ收稿日期：２０１００３２２修回日期：２０１００４２０基金项目：浙江省自然科学基金（Ｙ２０６２８０）；浙江省教育厅科研项目（Ｙ２００７００７１）．作者简介：周群燕（１９

8、８２－），女，博士生，从事消化内科工作．通讯作者：姒健敏（１９５７－），男，教授，博士生导师，主要从事消化内科临床及基础研究；Ｅｍａｉｌ：ｓｉｊｍ＠ｚｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ·５００·浙江大学学报（医学版）第３９卷ｄｅｔｅｃ