姜黄素诱导人食管癌ec-9706细胞凋亡及其机制的研究

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。研究生签名：赵蠹会导师院领导签名：月2富日河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成

2、果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。．．研究生签名：赵耄冷导师签名堙日中文摘要姜黄素诱导人食管癌Ec．9706细胞凋亡及其机制的研究摘要目的：食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，我国是食管癌的高发国家，每年因食管癌死亡的人数占全部恶性肿瘤死亡的近四分之一。目前治疗食管癌除早期手术，化学药物已成为治疗恶性肿瘤的重要方法，但是绝大多数化学药物的细胞毒作用缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，无选择的杀伤正常细胞。因此，寻找毒副作用小，抗瘤活性强的化疗药物已成为国内外研究的热点。姜黄素是从姜黄属植物姜黄的根茎中提取的一种植物多酚，可用于食品上色及佐味

3、。近年研究发现其药理作用广泛，如抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂、抗动脉硬化及抗肿瘤等作用。尤其姜黄素可诱导多种肿瘤细胞凋亡，作为一种具有良好发展前景的抗癌药物，日益引起人们的关注，但对人食管癌的作用及分子机制研究较少，本研究通过体外培养人食管癌Ec．9706细胞，研究姜黄素作用后细胞形态、细胞凋亡及其调控基因表达的影响，探讨姜黄素在食管癌细胞中的作用机制，为食管癌的化学防治提供实验依据。肿瘤发生不仅是瘤细胞的过度增生，还存在死亡过少，凋亡机制障碍，细胞凋亡参与肿瘤起始过程，并对肿瘤发生发展起负调控作用。本研究运用多种实验技术，对细胞凋亡中凋亡抑制蛋白因子(Livin

4、)，促凋亡因子(Smac)矛1]Caspase．3中文摘要进行检测和分析，以期进一步阐明细胞凋亡调控基因在肿瘤发生发展中的作用。方法：将Ec．9706细胞于37℃，饱和湿度5％C02的常规条件下培养，待细胞进入对数生长期后用于实验。l应用光镜观察细胞形态学变化：将不同浓度的姜黄素作用于Ec．9706细胞，在倒置相差显微镜下定时观察细胞的生长情况并照相。2采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测药物对细胞的生长抑制作用。3流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡、细胞周期分布：收集经不同浓度姜黄素作用12h、24h、48h的Ec．9706细胞及对照组细胞，冷PBS漂洗。预冷70

5、％乙醇4"C，固定，上机检测前离心去固定液，O．5％胃蛋白酶消化，碘化丙锭(PropidiumIodide，PI：50mg／LTrintonX-1001．O％)室温避光染色。流式细胞仪上机检测，应用软件进行分析。4FCM检测caspase．3蛋白的表达：收集经不同浓度姜黄素作用12h、24h、48h的Ec．9706细胞及对照组细胞，按常规方法进行荧光标记，流式细胞仪检测荧光强度，以荧光指数(FI)表示蛋白的表达情况。5应用免疫细胞化学方法观察细胞凋亡调控因子Srnac、Caspase3蛋白表达的变化。6westernblot半定量检测基因蛋白Livin、Smac

6、、Caspase3表达，并分析各蛋白表达之间的相关性及其在姜黄素抗食管癌中的作用机制。结果：中文摘要姜黄素对Ec．9706细胞凋亡及其调控基因的影响1经40、80、120、160}tmol／ml姜黄素处理Ec．9706细胞12h、24h和48h后，倒置相差显微镜下观察，与对照组相比，用药组的细胞生长明显被抑制，胞浆内颗粒增多增粗，核浆比例降低，部分细胞变圆而悬浮在培养基内。提示Ec．9706细胞趋于凋亡。2分别用姜黄素(O、40、80、120、160Iamol／m1)作用于Ec．9706细胞12、24、48h，MTT结果显示姜黄素能明显抑制Ec．9706细胞的增

7、殖，并呈剂量和时间依赖性。作用12h、24h和48h后，Ec．9706细胞半数抑制率(inhibitoryconcentrationgiving50％inhibition，IC50)分别为216．1447pmol／ml，148．06359mol／ml和113．80459mol／ml(p<0．01)。最高增殖抑制率为：应用160pmol／ml姜黄素处理Ec．9706细胞48小时后，其增殖抑制率达到73．19％。溶剂对细胞生长未见明显影响俨>O．05)。3流式细胞仪分析细胞凋亡，在DNA组方图上出现典型的亚二倍体峰即“凋亡峰"。40、80、120和160pmol／m

8、l姜黄素作用12h后的凋