高效液相法测定牛黄上清片中胆红素含量

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1、高效液相法测定牛黄上清片中胆红素含量【中图分类号】R286【文献标识码】A【文章编号】1672－3783(2011)08－0357－01【摘要】目的：建立牛黄上清片中人工牛黄的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法测定牛黄上清片中胆红素的含量,以SpursilTMC18（4.6mm×250mm,5μm）为分析柱，四氢呋喃-乙腈-0.1%醋酸铵（pH4.7）（42：22：36）为流动相；流速：1.0mL•min-1；检测波长：452nm；进样量20μl。结果胆红素对照品在14.01～280.20ng范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系Y=4.87X-3.41×104，r=0

2、.9997；平均回收率为98.5%，RSD为0.8%(n=9)。结论本法简便，准确，专属性强,可以作为该制剂的质量控制方法。【关键词】牛黄上清片；人工牛黄；胆红素；高效液相色谱6牛黄上清片由人工牛黄、菊花、黄苓、大黄、石膏等十九味药加辅料制成，具有清热泻火，散风止痛。用于热毒内盛、风火上攻所致的头痛眩晕、目赤耳鸣、咽喉肿痛，口舌生疮、牙龈肿痛、大便燥结的功效［1］。人工牛黄为该药的重要组成部分，其中胆红素为人工牛黄的特征性有效成分。本文采用高效液相色谱法测定人工牛黄中胆红素的含量，为牛黄上清片的质量控制提供参考。�1仪器与试药岛津LC-20AT泵，SPD-M20A检测器，SIL-20A

3、自动进样器，LC-Solution色谱工作站；奥波超声波清洗机（工作频率：40±1.5KHz，输出功率：400W）；胆红素对照品（中国食品药品检定研究院批号：100077-200805），牛黄上清片市场购得，四氢呋喃为色谱纯（ManufacturedbySKChemicalsUlsan680-160,korea），乙腈（ManufacturedbySKChemicalsUlsan680-160,korea），其它试剂均为分析纯，水为纯化水。�2方法与结果2.1色谱条件色谱柱：SpursilTMC18（4.6mm×250mm,5μm）；流动相:四氢呋喃-乙腈-0.1%醋酸铵（pH4.7）

4、（42：22：36）；流速：1.0mL•min-1；检测波长：452nm；进样量：20μL；理论板数按胆红素计不小于5000；采用外标法检测。按上述色谱条件实验，分别精密量取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，胆红素三个异构体之间和样品中的其它成分均能完全分离，且阴性对照溶液在胆红素三个异构体的峰位置上没有吸收峰。见图1�1牛黄上清片高效液相色谱图6A.胆红素对照品B.供试品C.阴性对照1:胆红素Ⅲa2:胆红素IXa3:胆红素Ⅷa2.2对照品溶液的制备精密称取胆红素对照品(五氧化二磷室温减压干燥至恒重)约12mg置100mL棕色容量瓶

5、中,加三氯甲烷约30mL使溶后,用四氢呋喃定容至刻度,摇匀,精密量取溶液1mL至50mL棕色容量瓶中,加四氢呋喃－三氯甲烷（3：1）混合溶液稀释定容至刻度,摇匀,即为对照品溶液。2.3供试品溶液的制备取本品20片，精密称定，研细，混匀，精密称取适量（约相当于人工牛黄10mg）置50mL棕色容量瓶中，精密加入四氢呋喃－三氯甲烷（3：1）混合溶液25mL，称定重量，置超声波清洗器中室温超声45分钟后，用四氢呋喃－三氯甲烷（3：1）混合溶液补足减失的重量，摇匀,静置，取上清液，用0.45um微孔滤膜滤过,精密量取续滤液20μL注入液相色谱仪,记录色谱图，按外标法以峰面积计算每片样品胆红素的含

6、量（μg/片）。2.4阴性对照液的制备取牛黄上清片不含人工牛黄的处方组成药材，按供试品的制备方法制成的溶液作为阴性对照液。2.5线性关系考察6精密称取胆红素对照品(五氧化二磷室温减压干燥至恒重)14.01mg置100mL棕色容量瓶中,加三氯甲烷约30ml使胆红素溶解后，用四氢呋喃定容至刻度，摇匀，作为对照品储备液，精密量取上述溶液1mL置10mL棕色容量瓶中，加四氢呋喃－三氯甲烷（3：1）混合溶液稀释定容至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1，2，4，8，10，20μL注入色谱仪，记录色谱图，以胆红素的重量（X）为横座标，主峰面积（Y）为纵座标，经统计得回归方程为：Y=4.87X-3.41×

7、104，r=0.9997。结果表明胆红素对照品在14.01～280.20ng范围内呈良好的线性关系。2.6精密度试验精密量取浓度为2.511μg•mL-1对照品溶液，重复进样6次，胆红素主峰面积的RSD为0.41%。2.7稳定性试验分别取浓度为4.203μg•mL-1对照品溶液，分别放置0，1，2，3，4，6，12h后进样，计算胆红素主峰面积的RSD，结果为1.2%,表明对照品溶液在12h内稳定。2.8回收率试验精密称取