新鲜人羊膜负载构建兔角膜上皮

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1、新鲜人羊膜负载构建兔角膜上皮【摘要】目的新鲜人羊膜负载构建兔角膜上皮，为全角膜组织工程作基础。方法采用组织块法培养兔角膜缘干细胞，以新鲜人羊膜为载体，形成单层细胞膜片后用于传代；采用相差显微镜进行形态观察及AE5、p63免疫荧光鉴定。结果培养24h，兔角膜缘组织块边缘可见有细胞长出，之后形成“沙滩样”移形带，培养至7～8d细胞在羊膜上形成单层膜状，细胞透明，边缘整齐，形态呈多样化，以卵圆形和多边形为主；AE5抗体、p63抗体染色阳性细胞比例分别为（41.72±11.35）%、（21.57±6.36）%；2代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，无显著性差异（P﹥0.05）；3代

2、AE5和p63阳性细胞比例与原代比较，差异有统计学意义（P﹤0.05）；但4代AE5阳性细胞比例又明显升高。结论以新鲜羊膜为载体、采用组织块法培养角膜缘干细胞可获得较好的角膜上皮片，在传代细胞中，3代细胞分化程度最低、增殖能力最强，最适合移植。【关键词】角膜缘干细胞；新鲜羊膜；细胞培养【Abstract】ObjectiveToproducerabbitcornealepitheliumbalstemcellonhumanfreshamnion.MethodsRabbitlimbalepitheliumanfreshamnionbytissueblockmethod.Iteary

3、cellsformedmonolayercellpatch.Keratin3(AE5)andp63aryandfourgenerationcellsmunofluorescence.Contrastphasemicroscopethelimbaltissueblocked,andconfluentmonolayercellpatchappearedarycells.PositivepercentagesofAE5andp63arycells(P﹥0.05),arycells(P﹤0.05),andAE5positivecellsincreasedinthefourthgener

4、ation.ConclusionCornealepitheliumisproducedbalstemcellbymethodoftissueblockonhumanfreshamnion.Amongallgenerations,thethirdgenerationcellsaremostsuitabletobetranslated,becauseofthelobalstemcells，freshamnion，cellculture组织工程构建角膜上皮是组织工程化全角膜的课题之一。角膜缘干细胞是角膜上皮细胞增殖、分化和移行的，目前这一观点已经得到公认。种子细胞问题解决后，载体的选

5、择已成为研究重点。本课题组采用新鲜羊膜负载培养角膜缘干细胞，为角膜上皮组织工程的载体选择提供参考。1材料与方法1.1材料1.1.1组织：兔眼取自健康纯系新西兰大白兔，雌雄不限，体质量2～2.5kg，由重庆医科大学动物中心提供，在实验前用0.25％氯霉素滴眼液点眼，4次/日，共3d。羊膜取自排除肝炎病毒、AIDS病毒及梅毒等传染病的剖腹产妇的胎盘。1.1.2主要试剂：DMEM/F12培养液、胎牛血清（美国Hyclone公司），鼠抗兔单克隆AE5抗体（K3抗体）、鼠抗兔单克隆抗体p63（英国Abcam公司），免疫荧光染色试剂盒（Sigma公司），硝酸纤维素膜（北京鼎国生物制品公司）

6、，青霉素、链霉素、庆大霉素（上海生物工程技术服务有限公司）。1.1.3主要仪器：相差显微镜(LikonUFXⅡ型，OLYMPUS日本)，CO2培养箱(2300型SHELDON美国)，眼科显微手术器材等。1.2方法1.2.1新鲜羊膜的制备：①羊膜取材：含抗生素（4000U/ml的庆大霉素、青霉素500U/ml、链霉素500μg/ml）PBS洗去胎盘的血凝块，钝性剥离羊膜，使其与绒毛膜分离，同时用含抗生素的PBS冲洗干净后浸泡20min，上皮面朝上平铺于硝酸纤维素膜上。将上述附有羊膜的纸片修剪成2.5cm×2.5cm的小块。PBS冲洗2次，置于细胞培养板中DMEM/F12培养液

7、（含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，无血清）浸泡备用，所制羊膜均于取材后12h内使用。②羊膜去上皮：含0.25%胰蛋白酶和0.01%EDTA的消化液37℃消化40min，用细胞刮刀轻轻刮除上皮细胞，PBS清洗2次，相差显微镜下确认上皮细胞全部清除。上皮面朝上铺于盖玻片（22mm×22mm）上置于6孔培养板内。1.2.2兔角膜缘干细胞的原代培养（组织块法培养）：空气栓塞处死白兔，无菌条件下摘除眼球，去除角膜缘周围的附属组织，用含抗生素的PBS清洗3次，切取角膜缘组织，剪成1mm3