豚鼠耳蜗血管交感神经支配的逆行追踪与免疫组化相结合的双标论文

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1、豚鼠耳蜗血管交感神经支配的逆行追踪与免疫组化相结合的双标论文申宇鹏，邱建华，乔莉，刘顺利【关键词】螺旋蜗轴动脉；交感神经；酪氨酸单氧化酶；免疫组织化学；豚鼠【Abstract】AIM:Toinvestigatethedetailedinnervationpatternsofthesympatheticnervetothecochlearbloodvesselsandrelatedneurotransmittersintheguineapig.METHODS:Thespiralmodiolarartery(SMA

2、)inguineapigcochleaicrosurgery,thenthefluorogold(FG)orhorseradishperoxidase(HRP)ittersofthesesympatheticfibersaroundSMAmunohistochemicaldoublelabeledtechnique.RESULTS:Retrogradelylabeledneuronsaybeusedbysympatheticnervetoregulatecochlearbloodfloodiolarartery

3、;sympatheticnerve;tyrosine3monoorygenase;immunohistochemistry;guineapigs【摘要】目的：研究豚鼠耳蜗螺旋蜗轴动脉接受交感神经支配的具体来源情况及与该交感神经纤维调节功能相关的神经递质.方法：在正常豚鼠单侧耳蜗螺旋蜗轴动脉局部滴加逆行追踪剂辣根过氧化物酶(HRP)或荧光金(FG)，观察双侧交感颈上神经节、星状神经节内HRP或FG逆标神经元的分布；采用逆标与免疫组化相结合的双重标记方法观察追踪阳性神经元是否表达酪氨酸羟化酶(TH)、神经肽Y(NP

4、Y)、钙基因相关肽(CGRP)或P物质(SP).结果：同侧颈上神经节内可见逆行追踪阳性神经元胞体，对侧颈上及双侧星状神经节内却未见阳性细胞；阳性神经元多同时呈TH,NPY阳性，但未见CGRP或SP双标的阳性神经元.结论：豚鼠颈上神经节内存在TH及NPY阳性神经元支配同侧耳蜗血管，去甲肾上腺素和神经肽Y可能是交感神经节后纤维调节耳蜗血流的递质或调质.【关键词】螺旋蜗轴动脉；交感神经；酪氨酸单氧化酶；免疫组织化学；豚鼠0引言耳蜗正常的血液供应对维持其生理功能及内环境稳定具有重要意义.freelann等［2］在体外实

5、验观察到耳蜗的主要供血动脉如：基底动脉、小脑前下动脉及螺旋蜗轴动脉的收缩都受到交感神经的调节.邱建华等［3］观察到豚鼠螺旋蜗轴动脉及其放射状动脉周围均有不同程度的酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)免疫反应阳性神经纤维的分布.本研究旨在明确豚鼠耳蜗螺旋蜗轴动脉接受交感神经节后纤维支配的具体来源情况以及与该交感神经纤维调节功能相关的神经递质，为进一步研究交感神经对耳蜗血流的调节作用奠定基础.1材料和方法1.1材料选用健康、耳廓反射灵敏的白色豚鼠12只，由第四军医大学实验动物中心提供，体质量

6、(280±50)g，雌雄不拘，自由摄取食水.将豚鼠随机分为3组：辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)追踪组；荧光金(fluorogold,FG)追踪组和对照组.追踪用HRP及显色剂四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)购自德国Roche公司；免疫组织化学ABC试剂盒、兔抗神经肽Y(NPY)及P物质(SP)抗体(1∶100)购自武汉博士德生物制品有限公司；FG及兔抗TH,钙基因相关肽(CGRP)抗体(1∶5000)均购于美国Sigma公司.1.2方法1.2

7、.1动物模型制作采用20g/L戊巴比妥钠(40mg/kg)肌肉注射麻醉，所有动物术前测试听觉脑干反应（auditorybrainstemresponse,ABR）均为正常，均选择右耳手术.手术采取右颈侧进路，切断茎突及其附着肌腱后打开听泡，暴露耳蜗并拭去底转外侧壁表面黏膜，微型钻于耳蜗底转行骨壁开窗，直径约1.5mm，吸除外淋巴液，高倍显微镜下去除部分基底膜及骨性螺旋板，仔细暴露螺旋蜗轴动脉(spiralmodiolarartery,SMA)，将浸有1μL追踪剂（300g/LHRP或30g/LFG溶于生理盐水）

8、的明胶海绵微球置于SMA表面，术中避免追踪剂流入中耳腔，骨水泥封闭耳蜗骨窗及听泡开口，缝合关闭伤口，应用磺胺嘧啶钠预防感染.对照组使用生理盐水代替300g/LHRP溶液.1.2.2取材、切片HRP追踪组豚鼠术后存活48h，FG追踪组豚鼠术后存活7d.采用20g/L戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后，开胸经心脏升主动脉插管灌注生理盐水200mL冲出血液，继之用低温(4℃)含40g