豚鼠耳蜗血管交感神经支配的逆行追踪与免疫组化相结合的双标

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1、豚鼠耳蜗血管交感神经支配的逆行追踪与免疫组化相结合的双标作者：申宇鹏，邱建华，乔莉，刘顺利【关键词】螺旋蜗轴动脉；交感神经；酪氨酸单氧化酶；免疫组织化学；豚鼠【Abstract】AIM:Toinvestigatethedetailedinnervationpatternsofthesympatheticnervetothecochlearbloodvesselsandrelatedneurotransmittersintheguineapig.METHODS:Thespiralmodiolarartery(SMA

2、)inguineapigcochleaicrosurgery,thenthefluorogold(FG)orhorseradishperoxidase(HRP)ittersofthesesympatheticfibersaroundSMAmunohistochemicaldoublelabeledtechnique.RESULTS:Retrogradelylabeledneuronsaybeusedbysympatheticnervetoregulatecochlearbloodfloodiolarartery;

3、sympatheticnerve;tyrosine3monoorygenase;immunohistochemistry;guineapigs【摘要】目的：研究豚鼠耳蜗螺旋蜗轴动脉接受交感神经支配的具体来源情况及与该交感神经纤维调节功能相关的神经递质.方法：在正常豚鼠单侧耳蜗螺旋蜗轴动脉局部滴加逆行追踪剂辣根过氧化物酶(HRP)或荧光金(FG)，观察双侧交感颈上神经节、星状神经节内HRP或FG逆标神经元的分布；采用逆标与免疫组化相结合的双重标记方法观察追踪阳性神经元是否表达酪氨酸羟化酶(TH)、神经肽Y(NPY)

4、、钙基因相关肽(CGRP)或P物质(SP).结果：同侧颈上神经节内可见逆行追踪阳性神经元胞体，对侧颈上及双侧星状神经节内却未见阳性细胞；阳性神经元多同时呈TH,NPY阳性，但未见CGRP或SP双标的阳性神经元.结论：豚鼠颈上神经节内存在TH及NPY阳性神经元支配同侧耳蜗血管，去甲肾上腺素和神经肽Y可能是交感神经节后纤维调节耳蜗血流的递质或调质.【关键词】螺旋蜗轴动脉；交感神经；酪氨酸单氧化酶；免疫组织化学；豚鼠0引言耳蜗正常的血液供应对维持其生理功能及内环境稳定具有重要意义，已证实耳蜗微血管存在复杂的调节机制，交

5、感神经系统、体循环血压、局部代谢产物、药物及血管活性肽等都会影响耳蜗血流.现有研究观察到哺乳动物耳蜗接受丰富的交感神经支配［1］，且这些交感神经纤维大多是去甲肾上腺素能的.B)购自德国Roche公司；免疫组织化学ABC试剂盒、兔抗神经肽Y(NPY)及P物质(SP)抗体(1∶100)购自武汉博士德生物制品有限公司；FG及兔抗TH,钙基因相关肽(CGRP)抗体(1∶5000)均购于美国Sigma公司.1.2方法1.2.1动物模型制作采用20g/L戊巴比妥钠(40mg/kg)肌肉注射麻醉，所有动物术前测试听觉脑干反应（

6、auditorybrainstemresponse,ABR）均为正常，均选择右耳手术.手术采取右颈侧进路，切断茎突及其附着肌腱后打开听泡，暴露耳蜗并拭去底转外侧壁表面黏膜，微型钻于耳蜗底转行骨壁开窗，直径约1.5mm，吸除外淋巴液，高倍显微镜下去除部分基底膜及骨性螺旋板，仔细暴露螺旋蜗轴动脉(spiralmodiolarartery,SMA)，将浸有1μL追踪剂（300g/LHRP或30g/LFG溶于生理盐水）的明胶海绵微球置于SMA表面，术中避免追踪剂流入中耳腔，骨水泥封闭耳蜗骨窗及听泡开口，缝合关闭伤口，应用

7、磺胺嘧啶钠预防感染.对照组使用生理盐水代替300g/LHRP溶液.1.2.2取材、切片HRP追踪组豚鼠术后存活48h，FG追踪组豚鼠术后存活7d.采用20g/L戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后，开胸经心脏升主动脉插管灌注生理盐水200mL冲出血液，继之用低温(4℃)含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)600mL，缓慢灌注固定2h.迅速分离暴露颈交感链，取下双侧颈上神经节及星状神经节，标本用新鲜40g/L多聚甲醛缓冲液后固定6～8h，经0.01mol/LPBS漂洗后置入300g/

8、L蔗糖磷酸缓冲液(pH7.4，4℃)至沉底.OCT胶包埋后用恒冷箱切片(CM1900,LEica,HEIdelberger,Nussloch,Germany)，片厚16μm.FG追踪组标本切片后即可在Olympus荧光显微镜下观察并照相，激发光波长为323nm.1.2.3免疫组化实验HRP追踪的切片分为5组，采用钨酸钠加强的TMB法行HRP显色反应，观察显色结果并照相.其