缺氧下外源性血管内皮生长因子对体外大鼠müller细胞的影响论文

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1、缺氧下外源性血管内皮生长因子对体外大鼠Müller细胞的影响论文刘晓娟惠延年郭斌张乐郝晓凤【摘要】目的：观察缺氧条件下外源性血管内皮细胞生长因子（VEGF）对体外大鼠Müller细胞的影响。方法：体外酶消化法纯化培养并鉴定大鼠Müller细胞。台盼兰染色测定细胞活性。应用光镜、细胞计数、免疫细胞化学、MTT法、原位细胞凋亡等方法分析Müller细胞在不同的缺氧时间（0~24h）、添加不同浓度VEGF（10～100μg/L）及VEGF受体Flk-1阻断剂SU1498处理后，细胞中VEGF和Flk-1，Flt-1的表达、细胞活性及凋亡等变化。结果：纯化培养

2、至第3代的Müller细胞，经鉴定其纯度为90%，活力是87.3%。缺氧8～12h时Müller细胞胶质源纤维酸性蛋白（GFAP）染色增强，VEGF和Flk-1，Flt-1表达增加，可见细胞肿胀、脱落。缺氧20h时.freelaryculturedratMüllercellsunderhypoxiainvitro.METHODS:TheratMüllercellsorphologyandglialfibrillaryacidicprotein(GFAP).Thecellviabilityicroscopy,MTTassay,TUNELlabelinga

3、ndSABCimmuno-histochemistryeasurethechangesofcellmorphology,gromixedcells(purity90%,viability87.3%inPassage3)andpassagedserially.Afterhypoxiafor8-12hours,theproliferationandviabilityofthecellsincreasedprogressively,andtheexpressionofGFAP,VEGF,Flk-1andFlt-1alsoincreased.Buttheinc

4、reasedcellsshoedium.Afterhypoxiafor20hours,.freelediumreached75μg/L,thecellviabilityincreased1.3foldandtheapoptosisindexreducestotalconditions,Flk-1andFlt-1expressedataloayexertneuroprotectiveeffectspartiallyontheMüllercellsviaVEGFreceptor-Flk-1andFlt-1invitro.·KEYüller细胞的影响。我们研

5、究缺氧条件和外源性VEGF处理后，Müller细胞中VEGF及Flt-1，Flk-1的表达，以期初步揭示缺氧条件下VEGF对Müller细胞的影响。1材料和方法1.1材料健康封闭群二级SD新生大鼠10只，由第四军医大学实验动物中心提供。培养Müller细胞的培养基DMEM和MTT试剂分别购自Gibco和Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青公司，GFAP抗体、VEGF受体Flk-1、Flt-1的抗体和VEGF抗体购自博士德公司；VEGF购自北京中杉公司；SABC试剂盒购自博士德公司，原位细胞凋亡检测试剂盒购自罗氏公司，其它化学试剂均为国产分析纯试剂。依

6、据改良的视网膜Müller细胞制备方法7-10。眼球取自出生1in，过双层的53μm尼龙筛网，400g离心10min，用含有100mL/L胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）的DMEM中和，400g离心10min。加入100mL/LFBS的DMEM1.5mL吹打细胞，悬浮接种于培养皿中，加入含有200mL/LFBS的DMEM培养液，培养于37℃，50mL/LCO2，950mL/L空气，3d换液，待细胞融合，加入含1g/L胰蛋白酶，待细胞收缩，部分细胞悬浮后，将其吸出弃掉，加入含200mL/LFBS的DMEM培养液继续培养。如此2～3遍，

7、细胞形态基本一致后，按1∶2比例进行传代，传3～4代后行免疫组织化学技术鉴定细胞：一抗为兔抗大鼠胶质源纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein,GFAP），二抗是FITC标记的抗兔IgG抗体，荧光显微镜观察。细胞纯度分析：计算单位视野内GFAP表达阳性的细胞占总细胞的比例。细胞活力分析：台盼兰染色，活细胞率＝拒染细胞数/（拒染细胞数＋染色细胞数）×100％。1.2方法缺氧模型的制作参照文献11，将氯化钴（CoCl2,Sigma产品）用去离子水溶解，配成200μmol/L的溶液，经过滤除菌后-4℃备用。将经纯化鉴定传至3~5

8、代融合前的Müller细胞接种于培养板中，培养24h后再置于缺氧条件下培养24h，或缺氧前加不