杆状病毒转导的小鼠羊水干细胞保持成骨分化潜能的实验研究论文

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1、杆状病毒转导的小鼠羊水干细胞保持成骨分化潜能的实验研究论文【摘要】目的探讨带有绿色荧光蛋白基因的重组杆状病毒修饰后的小鼠羊水干细胞(mouseamnioticfluidstemcells,mAFSs)是否仍保持成骨分化潜能。方法体外原代培养小鼠羊水干细胞，并进行成脂成骨诱导分化，鉴定多向分化潜能；体外构建并扩增重组杆状病毒（Baculovirus-CMV-GFP,Bv-GFP）；Bv-GFP体外转导小鼠羊水干细胞，流式细胞仪检测其转导效率；经Bv-GFP基因修饰后的小鼠羊水干细胞进行成骨诱导分化。结果小鼠羊水干细胞体外具有良好的增殖能力，3代后的细胞呈现较均一的梭形、漩

2、涡状生长，且小鼠羊水干细胞体外具有成脂成骨分化潜能。体外成功构建重组杆状病毒，经Sf9细胞扩增后，极度稀释法测定其滴度可达109v.g/ml；Bv-GFP体外可较有效转导小鼠羊水干细胞.freelouseamnioticfluidstemcells(mAFSs)maintainthepotentialofosteogenesisdifferentiationaftergenemodificationbygreenfluorescentprotein(GFP)labeledbaculovirus.MethodsmAFSsaryculturedinvitroandulti-

3、directionaldifferentiationplified,thenitAFSs,thetransfectionefficiencyeter;osteogenicdifferentiationcells.ResultsThemAFSshadgoodproliferationcapacity,cellsogeneouslyspindle-shapedafter3generationsandgreanner,alsotheyhadosteogenicandadipogenicdifferentiationpotential.Thereconstructedbacul

4、ovirusplification,thetilterlafterextremedilutionmethod；Bv-GFPcouldeffectivelytransfectedmAFSs,ainedosteogenicanddifferentiationpotentialaftergenemodification.ConclusionsmAFSsareidealstemcells,baculovirusisaneAFSsodifiedbyreconstructedbaculovirus,providesaneodeforbonetissueengineering.【Ke

5、ynioticfluidstemcellGenemodificationDifferentiationofosteogenesis外伤或手术时造成的骨损伤如不能自行修复，则会造成骨不愈合或骨缺损,常需自体或异体骨移植，但其效果并不确切,不但增加了病人的痛苦和经济负担，同时又存在许多并发症［1］。若在骨损伤的部位注入有成骨潜能的细胞并诱导其成骨分化，可能解决这一问题［1，2］。干细胞的发现和深入研究为这个设想带来了希望。干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的一类细胞，一般分为胚胎干细胞和成体干细胞。常见的成体干细胞如骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、脐血干细胞等，虽然大量的研究

6、证实它们可以于体内外成骨分化［2］，但取材较困难，且成骨分化潜能较低［2，3］；胚胎干细胞虽然具有较好地成骨分化潜能，但因其受伦理道德的限制及体内具有致瘤可能性，应用受限［4，5］。最近的大量研究表明，羊水中亦存在干细胞，在体内外具有很好的增殖能力［6～8］，它具有胚胎干细胞的特性，如表达SSEA、OCT-4等胚胎干细胞表面标志［6～9］，同时羊水干细胞于体内外都具有较好的成骨分化潜能［6～8］，且其取材容易，无伦理道德限制，故对于骨组织的修复研究来说，羊水干细胞是一种理想的种子细胞［10］。然而，干细胞在体内成骨分化受到多种因素的影响［11］，若在体外对干细胞进行基因

7、修饰，将会显著提高其在体内的成骨分化潜能［11］。目前，常用的基因载体如腺病毒载体、慢病毒载体、质粒载体有诸多缺陷而限制了的临床应用［12］。而杆状病毒包装载体容量大，对靶细胞无毒性作用，无致瘤性等优点［13］，是一种理想的病毒基因载体，但重组杆状病毒是否可有效转导羊水干细胞，以及转导后的羊水干细胞是否保持成骨分化潜能，目前国内外还没有相关报道。本研究旨在探讨体外Bv-GFP是否可有效转导小鼠羊水干细胞，以及对其成骨分化是否有影响，为今后的杆状病毒载体基因修饰羊水干细胞及运用于今后的骨组织重建工程研究奠定基础。1材料和方法1.1主要试剂及