蒙古羊羊水源干细胞的分离鉴定与其定向成骨分化的分析

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1、摘要本研究旨在分离鉴定蒙古羊羊水源干细胞（Amnioticfluid-derivedstemcells，AFSC），并对其生物学特征及分化潜能进行探究，为以AFSC为种质资源生产克隆羊、转基因羊奠定理论基础。经过培养不同孕期蒙古羊AFSC，发现羊水采集时间对AFSC的贴壁率及细胞活性影响较大，孕中期AFSC贴壁率比孕早期的高，细胞活性比孕晚期的强，采集AFSC的最佳时期为孕中期。15%FBS可维持孕中期蒙古羊AFSC增殖50代以上，其形态及生物特性保持不变，细胞生长速度及增殖能力无明显差异。细胞培养初

2、期，通过机械分离法，并有效配合胰蛋白酶消化时间，去除成纤维状细胞中混杂的上皮样细胞，可在5代之内纯化。纯化的AFSC形态上为梭型，细胞汇合有方向性，集落呈典型涡旋状排列。利用RT-PCR检测不同代数AFSC，结果表明蒙古羊AFSC表达干细胞标志基因Oct-4,Nanog,SH2,SSEA-1,CD117和HLA-A等。蒙古羊AFSC悬浮培养时，可形成典型的类胚体，并表达三胚层标志基因fgf5(外胚层)、α-fetoprotein(内胚层)和ζ-globin(中胚层)。利用地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷

3、酸钠对蒙古羊AFSC诱导后细胞生长相对变缓，边缘变模糊，局部出现复层生长，并形成颗粒状结节。诱导三周后细胞碱性磷酸酶活性显著增加，茜素红染色呈红色，表明诱导成功。研究结果表明本试验从蒙古羊羊水中分离得到的细胞具有一定的干细胞特性，在体外有很强的增殖和分化能力，并在特定条件下可形成成骨细胞。关键词：AFSC；分离鉴定；诱导；成骨细胞IsolationandIdentificationofMongolianSheepAmniotic Fluid-derivedStemCellsandItsInductio

4、nintoOsteoblastsAbstractTheaimofthisstudywastoisolateandidentifyMongoliansheepamnioticfluid-derivedstemcells,andtodetectthebiologicalcharacteristicsanddifferentiationpotentialofAFSC.Thisstudylayatheoreticalfoundationforgeneratingtheclonedsheepandthetran

5、sgenicsheepwhichderivedfromAFSC.TheMongoliansheepAFSCfromdifferentgestationstagewerecultured,theresultshowedthattheadhere-rateandactivityofcellswasgreatlyaffectedbythetimeofamnioticfluidacquisition.Theadhere-rateofcellsinthemid-gestationwashigherthantha

6、tofearlygestation.Theactivityofcellsinthemid-gestationwashigherthanthatoflate-gestation.ThebesttimeofAFSCacquisitionwasthemid-gestation.BiologicalcharacteristicsandconfigurationofAFSCafteralong-termcultivationwith50thormorecellpassagesustainedstablewhen

7、15%FBSaddedincellmedium.AFSCcouldbepurifiedwithin5thpassagebymechanicalseparationcombinatedwithdefineddigestingtimewithtrypsintoremovetheepithelioidcellsfromfibrouscells.Thesecellswereshuttle-type,cellconfluencedirectional,andthecolonywasvortex-likearra

8、ngement.TheresultshowedthatOct-4,Nanog,SH2,SSEA-1,CD117andHLA-AwereexpressedindifferentpassageAFSCbyRT-PCR.AFSCwereabletoformtheembryoidbodyinvitro,whichexpressmarkergenesofthreeembryonicgermlayersincludingfgf5(ectoderm)、α-fetopr