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时间:2018-07-06
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1、孕酮对缺血再灌注沙土鼠海马CB神经元的保护作用论文褚丽芳张震李双成王建华【摘要】目的观察孕酮对脑缺血沙土鼠海马钙结合蛋白CalbindinD-28k,即CB免疫反应的影响。方法以颈总动脉夹闭法制作脑缺血再灌注模型、免疫细胞化学方法显示海马CB免疫反应的变化。结果脑缺血再灌注后1~7天,背侧海马CA1区CB阳性神经元开始出现并且数量增多;第7天背侧海马CA1区锥体细胞层呈现CB阳性死亡着色致密条带。孕酮处理后背侧海马CA1区CB阳性神经元进一步增加,且有较长的突起伸至腔隙分子层,未见海马CA1区锥体细胞层CB阳性死亡着色致密条带结构。结论孕酮具有一
2、定的神经保护作用,调控CB的表达可能为孕酮的作用机制之一。【关键词】孕酮脑缺血钙结合蛋白沙土亚科孕酮(progesterone)作为一种能在神经系统合成的神经活性甾体,通过对神经系统结构和功能的影响,发挥其神经营养和保护作用。研究表明.freelg/kg)。1.2动物模型的制备脑缺血再灌组和孕酮处理组经乙醚麻醉后,按Zealonga等5的方法,行颈正中切口,游离夹闭双侧颈总动脉、阻断血流20min后,去除动脉夹,缝合切口,制成沙土鼠脑缺血再灌注模型。假手术组除不夹闭颈总动脉外,其余同上。1.3标本制备各组动物在预定存活时间2d或7d,经心灌注生理
3、盐水50ml和4℃4%多聚甲醛固定液(pH7.6)400ml后,开颅取脑,于4%多聚甲醛中后固定4h,30%蔗糖过夜,冠状位冰冻切片厚40μm,间断集片于0.01mol/L,pH7.6PBS中,行免疫细胞化学反应。用1:2000小鼠抗CB抗体(sigma)于4℃孵育切片48h;1:400生物素化第二抗体室温2h;1:400HRP结合链霉亲合素室温1h;行DAB呈色。免疫细胞化学对照实验以PBS代替CB抗体进行反应,其结果为阴性。切片脱水、树脂封片。1.4细胞计数及免疫细胞化学染色每只动物随机选择3张切片的背侧海马CA1区、CA3区锥体细胞层及齿状
4、回颗粒细胞层,观察并计数神经元,因数量较少数据并未列出。依据免疫反应强度分为五级,-,未检测出;±,偶见表达;+,表达较弱;++,中等强度表达;+++,强阳性表达。2结果免疫细胞化学染色发现,假手术组沙土鼠齿状回颗粒细胞及突起CB免疫反应呈强阳性,强阳性的CB免疫反应颗粒细胞及突起之间彼此界限不清表现为一致密带,同时可见自海马齿状回至海马CA3区汇集的CB阳性苔藓纤维。背侧海马CA1区、CA3区锥体细胞层为CB阴性,在CA1区起层、放射层及腔隙分子层可见散在的CB阳性神经元,在齿状回门区偶见散在的阳性锥体细胞(图1,表1)。腹侧海马CA1区锥体细
5、胞层浅层可见大量CB阳性锥体细胞,其较长的顶树突经放射层伸向腔隙分子层并与该层的CB阳性中间神经元及树突交织成网状。脑缺血各时程组背侧海马CA1区、CA3区起层、放射层的CB阳性非锥体神经元未见改变。脑缺血第2d,背侧海马CA1区锥体细胞层隐约可见CB阳性细胞、并较具细胞形态(图2);第7d,该区锥体细胞层细胞明显固缩、表现为深染致密的棕黄色条带-点状影像、无细胞轮廓-死亡着色(图3,表1)。但脑缺血第7d,腹侧海马CA1区没有死亡着色现象,仍可见大量的CB阳性锥体细胞及其突起。孕酮实验组与假手术组及脑缺血组相比,最大不同之处即表现在背侧海马CA
6、1区上,其他部位未见明显区别。本组第2d,可见背侧海马CA1区锥体细胞层的锥体细胞表达CB,其阳性细胞呈弱至中等反应强度、具有较长的突起伸至腔隙分子层,细胞形态清楚(图4,表1)。第7d,背侧海马CA1区锥体细胞层未见脑缺血组细胞固缩的棕黄色点状颗粒影像,背侧海马CA1区锥体细胞层可见大量的CB弱阳性的细胞,具有较明显的细胞形态,较长的阳性顶树突像第2d样伸至腔隙分子层(图5,表1)。3讨论本研究发现沙土鼠脑缺血再灌注后,背侧海马CA1区CB阳性神经元出现并且数量增多,与Yenari等6研究结果相符。海马CB阳性神经元数量增加可能与脑缺血后钙离子
7、内流、CB与之结合提高检出率有关7;也可能与脑缺血后兴奋性氨基酸大量释放,引起胞外钙离子内流8、诱发神经元合成更多的CB以增强缓冲胞内钙离子的能力有关。脑缺血再灌海马CA1区出现迟发性细胞死亡后,仍可见许多CB阳性神经元,我们在脑缺血再灌7d所观察到的海马CA1区CB阳性致密条带(密集点状死亡着色)可能是锥体细胞迟发性死亡后、分布于锥体细胞层的CB阳性纤维末梢固缩浓聚而致9。本研究发现,孕酮可提高脑缺血再灌后海马CB阳性神经元数量、增加CB阳性纤维突起(特别是第7d),这可能与孕酮的神经保护作用有关。沙土鼠脑缺血再灌后,孕酮对海马CA1区锥体细胞
8、具有明显的神经保护作用9-11。在Cervantes等12的实验中,发现孕酮不仅可以减少尾状核神经元的丢失,而且可增强黑质GABA能神经
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