甜高粱蔗糖整合酶基因克隆与转epsps基因研究

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1、甜高粱蔗糖整合酶基因克隆与转EPSPS基因研究1前言1.1生物质能源作物概况及我国发展生物质能源的合理选择生物质是所有的土地和水生植物以及有机废物的综合。生物质能源是植物经由太阳辖射加工转化的化学态能量。由于其以植物为能量载体，因此具有稳定性和储能可以同时产生生产能源及物质性产品的特点使其具有原料上的多样性。根据载体物质的不同，现主要将生物质能源划分为四类：油脂类作物、淀粉类作物、糖类作物及木质纤维素类作物。涉及发酵酒精的能源作物主要有淀粉类作物（玉米、木薯、马铃薯和小麦等粮食作物）、糖类作物（甘蔗、甜菜和甜高粱等）和纤维素类作物(萬麻等）（徐芬芬等

2、，2006)。生物质能源相较于其他能源主要具有资源品种丰富、可再生、抗逆性强、生产周期短、高效能量产出、不受地域限制、环境友好、生产安全等优势（张卫明，2007)。由于生物质能源产业市场尚未成熟所造成的企业投入大，各国政府都出台了相关补贴政策以推动本国生物质能源产业的快速发展。巴西政府经过长达30年的甘蔗发酵酒精的研究与应用，已具备成熟的酒精生产、运输及分销体系。瑞典利用作物废物（甜高粱稻秆等）生产固体成型燃料已经发展的相当成熟；日本改进了从国外引进的固化成型技术，研制了棒状燃料成型机和相关的燃料设备，具备成熟的压缩型燃料工业体系；美国国会制定了《生

3、物技术路线图》，并新建相关项目办公室和技术咨询委员会旨在给与进行生物质能源开发的公司政策咨询及技术指导（孙宏岭，2010)。2012年燃料乙醇生产量达到100亿加企。1.2能源作物甜高粱的研究进展Linnaeus于1753年首次对高粱进行了定义。之后Moench正式对高粱属进行了分类。目前所使用的高粱分类学概念为Moench所提出的的。栽培甜高粱隶属于禾本科高梁族高梁属甜高梁种下的亚种，拉rr名为Sorghumbicolor(Lin)Moenchsubsp.bicolor，英文名为sorghum，英文中的sorghum还指甜高粱种甚至泛指高粱属植物(

4、BarkaJ.H等2007)。甜高粱作为能源植物具有以下几点优势：首先，甜高粱具有很强的生长能力。在广西一年可种植两季，北方可种植一季，单株最高可达5米，每公顷可产粮食5000kg，每公顷糖产量约为75吨，高产纪录为160t/hin2;其次，甜高粱具有抗逆性强、适应性广的特点。其在三十多度高温干旱恶劣环境下，柱头和花粉仍可维持2小时左右生活力，而此种环境下的玉米只有十几分钟的寿命。其对盐碱的承受浓度也高于玉米灯作物，能耐受的盐浓度范围为0.5%-0.9%，譬如：将甜高粱种植在山东滨州盐碱地上，最高亩产甜高粱鲜结秆仍可达5565kg。其适应性广，在pH

5、5-8.5的各种类型土壤中均可栽培，在l0以上积温达2600tM50就可以生长，因此只要选在合适品种，我国各省均可种植甜高粱。甜高粱主要通过种子繁殖，适于机械播种和收获（PengY等，1999);再次，田宜水等（2011)年对甜高粱莲干乙醇全生命周期的分析表明：甜高粱乙醇能量产出投入比为1.34,相较于玉米乙醇生命周期的能量产比小于1,木薯乙醇技术路线在生命周期化石能消耗与传统汽油技术路线相比并无优势，甜高粱乙醇作为生物质能源具有很大优势；最后，随着科技的发展，新型技术不断应用于甜高粱莲干发酵乙醇中去。王闻等于2011年中国可再生能源学会上就发表了一

6、种促进甜高粱杆渔酶解的试验方法，大大提高了了其聚糖转化率。2北甜三号簾糖合成酶基因克隆2.1材料与方法购于北京天恩泽公司的DNA片段回收试剂盒，购于上海生工生物工程技术服务有限公司的T4DNAligase、X-gal、IPTG,以及购于TAKARA公司的LA-Taq高保真酶。常用溶液、缓冲液均用蒸馈水配制，15Mpa压力下湿热灭菌20分钟。常用试剂如下：2XCTAB：100l/LTris-Hcl,20mmol/LEDTA,1.4mol/LNacl,2%CTAB,2%PVP,0.4%巯基乙醇；氯仿/异戊醇(24:1):配置100体积比的氯仿/异戊醇需氯

7、仿96ml,异戊醇4ml；CTAB/Nacl：15%CTAB,OJmol/LNacl；TE溶液：l0mol/LTris-Cl,1mmol/LEDTA,PH8.0；异丙醇；75%乙醇；5XTBE：54gTris,27.5g硼酸，20ml0.5mol/LEDTA(PH8.0),使用时稀释10倍；50XTAE：24.2gTris,10ml0.5mol/LEDTA(PH8.0),5.71ml冰醋酸，使用时稀释50倍；X-gal(5-溴-4氯-3n引哚-P-D-半乳糖苷）It备液：用二甲基甲酰胺配制20mg/ml浓度的X-gal母液，装入2rnl离心管中，装溶

8、液的离心管应以黑色遮光纸包裹，这是由于X-gal易于见光分解。之后将其置于-20°C条件下保存。注：