epsps基因的克隆及转化甜高粱的初步研究

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1、广西大学硕士学位论文EPSPS基因的克隆及转化甜高粱的初步研究姓名：谢鸿锴申请学位级别：硕士专业：作物栽培学与耕作学指导教师：禤维言201206EPSPS基因的克隆及转化甜高粱的初步研究摘要5．烯醇丙酮酰-莽草酸一3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatesynthase)基因，简称剧强雕基因，植物细胞主要通过明，娜作用活性位点变化产生对除草剂草甘膦的抗性，即我们通常所说的EPSPS抗草甘膦基因。目前在美国普及的抗草甘膦大豆就是根据这个作用机理研制而成的，它的外源基因最初来自土壤杆菌(Agrob

2、acteriumsp．)CP4菌株中的脚合成酶基因，简称CP4-EPSPS基因。甜高粱是目前公认的最具优势的糖料作物、饲料作物和能源作物。然而截止目前，在生产上，抗逆性状优良的甜高梁品种仍需进一步去改造。利用转基因技术，对现有的甜高粱品种进行性状改良及分子遗传学基础研究具有很大的意义，其中抗除草剂性能也是一个非常重要的方面。为了有望能够获得高抗逆性的新品种，建立甜高粱高效稳定的遗传转化体系起到了关键作用，它对研制转基因抗除草剂甜高梁新品种显得尤为重要。本研究从抗草甘膦转基因大豆中克隆出刷强船基因，构建好植物表达载体，然后导入农杆菌，以供下

3、一步的遗传转化。并以引种至广西南宁种植的北甜三号(BT3)的成熟种子为外植体，先建立了高效、稳定的再生体系，再探讨了农杆菌介导的遗传转化。目前取得的主要研究结果如下：1、从抗草甘膦大豆中克隆到励瑚咯基因全长，测序验证序列完全正确，该片段全长1368bp，共编码455个氨基酸。以植物表达载体PCAMBIAl300为载体，UBI和NOS分别为启动子和终止子，构建了剧峪嗾达载体。2、建立了高效稳定的甜高粱BT3组织培养再生体系。以成熟种子为外植体，采用95％酒精处理30．50S，无菌水冲洗一次，再用0．2％的升汞处理23min，无菌水冲洗3．4

4、次可以达到理想的消毒效果。最佳诱导胚性愈伤的培养基为MS+2．0mg／L2,4-D+0．05mg／L6-BA；有效的增殖培养基为MS+I．5mg／L2,4．D+0．05mg／L6-BA；高效的分化培养基为MS+I．0mg／L6-BA+0．1mg／LNAA；生根培养基为1／2MS+0．05mg／LIBA和1／2MS+2．0me,／LIBA均可。3、筛选出甜高粱胚性愈伤的潮霉素抗性临界浓度为75mg／L，25mg／L的潮霉素浓度完全不能抑制住非转基因愈伤的生长，50mg／L潮霉素浓度培养基上还会产生个别数量的新愈伤，100mg／I脓度下愈伤全

5、部迅速死亡，而75mg／L浓度培养基上还会产生1．11％的新愈伤存活率，在假阳性合理的范围内。也筛选出了羧苄霉素抑制农杆菌的最佳浓度为500mg／L，也不会影响甜高粱愈伤的生长。所以MS+I．5mg／L2,4．D+0．05mg／L6-BA+75mg／L潮霉素+500mg／L羧苄的筛选培养基是可行的。关键词：甜高粱；EPSPS；植物表达载体；遗传转化；IICLONINGOFE只S只SGENEANDPRELIMINARYSTUDYONSWEETSORGHUMTRANSFORMATIONXieHong-kai(CollegeofAgricult

6、ure，GuangxiUniversity,Nanning530004，China)ABSTRACTThegeneof5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatesynthaseWaSsimplycalledEPSPS．PlantcellproducedtheresistanceofglyphosateofherbicidemainlythroughEPsPSactivesite÷Schanges，SOthegeneofglyphosate—resistantwasknownbyUSaSEPSPS．Atprese

7、nt，theglyphosate-resistantsoybCallSwhichwerewidelyplantedintheUnitedStatesweredevelopedonthebaSisofthismechanism．ItsexogenousgenewhatWaSsimplycalledCP4-EPSPSgeneoriginallycamefromthegeneofEPSPsynthaseintheCP4strainofsoilbacterium．NowsweetsorghumWasrecognized嬲themostadvant

8、ageofthesugar,feedandenergycrop．Butuptonow,thevarietiesofsweetsorghumwithexcellentresistantchara