甜高粱ssadh基因克隆鉴定及耐盐高粱品种的筛选

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1、西南科技大学研究生学位论文甜高粱SSADH基因克隆鉴定及耐盐高粱品种的筛选年级2012级姓名王龙海申请学位级别理学硕士专业生物化学与分子生物学指导老师朱莉副研究员ClassifiedIndex:U.D.C:SouthwestUniversityofScienceandTechnologyMasterDegreeThesisSweetSorghumSSADHGeneCloneIdentifyandSaltToleranceSorghumSpeciesScreeningGrade:2012Candidate:WangLonghaiAcademicDegreeAppliedfo

2、r:MasterSpeciality:BiochemistryandMolecularBiologySupervisor:AssociateResearchFellowAPR.02,2015独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。关于论文使用和授权的说明本人完全了解西南科技大学有关保留、使用学位

3、论文的规定，即：学校有权保留学位论文的复印件，允许该论文被查阅和借阅；学校可以公布该论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。（保密的学位论文在解密后应遵守此规定）西南科技大学硕士研究生学位论文第I页摘要γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid,GABA）代谢途径是TCA循环的一个代谢旁路途径，在动物中枢神经系统中发挥重要作用；而植物中，与植物响应各种生物胁迫和非生物胁迫密切相关。琥珀酸半醛脱氢酶SSADH是GABA途径的一个关键酶，不可逆性地催化琥珀酸半醛形成琥珀酸，后者进入三羧酸循环。已有的研究表明该基因与植物的生长发育、逆境胁迫应答密

4、切相关。甜高粱是一种重要的生物能源作物，具有多种抗逆特性，因此克隆并鉴定这些优良的抗逆基因对于作物的遗传育种改良具有重要意义。但是SSADH在甜高粱抗逆性中所起的作用，目前尚不清楚。本研究首次从甜高粱中克隆获得了SSADH基因的编码区序列；并对其进行了原核表达和酶活测定、亚细胞定位分析，同时利用农杆菌介导法进行高粱幼胚遗传转化，创建基因过表达株系等方面进行了研究。为今后深入研究SSADH基因与甜高粱抗性的关系提供重要依据。主要结果如下：1、利用RT-PCR技术首次从甜高粱Keller中克隆到了SSADH基因编码区序列。该序列全长1584bp，编码527个氨基酸，分子量大约

5、是52.45KD；基因结构与功能在线分析显示基因具有琥珀酸半醛脱氢酶活性结构域，和一个24个氨基酸的信号肽；与已知物种的SSADH基因编码区序列比对发现，序列相似度较高，仅信号肽部分差异较大。2、构建两个原核表达载体：一个全长的表达载体pET-28a-SSADH（1584）和截掉信号肽的原核表达载体pET-28a-SSADH（1386），仅pET-28a-SSADH(1386)表达出了SSADH蛋白；通过Ni-琼脂糖凝胶层析柱纯化出目的蛋白；并测出了蛋白的酶活，结果表明蛋白具有琥珀酸半醛脱氢酶的酶活，测得酶活为0.042units/mg蛋白；同时研究发现加入SSADH酶的

6、抑制剂AMP和ATP后，酶活被抑制。3、构建SSADH基因序列与GFP报告基因的融合表达载体，利用烟草叶片瞬时表达系统进行亚细胞定位分析，激光共聚焦显微镜（CLSM）分析结果表明，SSADH定位于线粒体中，与SSADH基因的功能预测相吻合。qRT-PCR分析了6个品种甜高粱的幼叶SSADH基因的表达情况，发现基因的表达差异不大。4、本实验通过构建甜高粱SSADH基因的过表达载体pH7WG2D-SSADH，并西南科技大学硕士研究生学位论文第II页以农杆菌侵染法，转化高粱BTX-SKU的愈伤组织，以潮霉素作为筛选剂，潮霉素筛选压50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml

7、依次增加，经过三轮筛选，获得SSADH基因的抗性愈伤；抗性愈伤已经进入再生培养和生根培养。5、实验通过0mM、100mM、200mM三个浓度梯度的NaCl处理11个不同的高粱种子；统计10天的发芽情况，并10天后收获幼苗、测量幼苗根重、根长、苗重和苗长分析高粱的耐盐性。筛选得到一个相对耐盐品种泰斯和一个盐敏感的品种10-80。以上研究结果为更进一步的研究甜高粱SSADH基因在甜高粱抗性特性中的具体功能和甜高粱育种奠定了一定的基础。关键词：甜高粱琥珀酸半醛脱氢酶原核表达亚细胞定位遗传转化西南科技大学硕士研究生学位论文第III页A