转几丁质酶基因、β

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1、转几丁质酶基因、β1前言1.1玉米纹枯病研究进展1.1.1玉米纹枯病病原菌玉米纹枯病是由丝核菌(Rhizoctonia)引起的土传病害，已报道的病原菌有三种：立枯丝核菌(R.soicmi)、未谷丝核菌(R.cerealis)、玉蜀黍丝核菌(高卫东，1987;Ogoshi,1987)。这三种土壤习居丝核菌属寄主十分广泛，自然发病的寄主有15科近200种植物，常以菌丝的形式在水稻、玉米、高粱、大豆等农作物上存活（侯明生和黄俊斌，2006)。纹枯病病菌不产生无性孢子，只产生菌丝体和菌核；其生长温度7-39°C，适温26-30°C；在PD

2、A上生长时菌丝开始为无色、较细、分隔距离较长，后期菌丝变粗变短，颜色变为棕紫色至褐色；菌丝分支呈直角、近直角或锐角，分支处溢缩有横膈膜；在PDA上培养2-3d后，在培养皿的周围产生菌核，菌核形成温度11-37°C，适温22°C，开始菌核呈白色，后变成黑褐色不规则形，较紧密，表面粗糖（侯明生和黄俊斌，2006)。玉米纹枯病主要侵害玉米叶鞘基部，其次是果穗和荀叶，病情严重时，能侵入玉米的莲杆（张培坤，2001)。玉米纹枯病的症状在叶鞘和叶片上表现为：形成暗绿色水渍状的椭圆形或不规则形纹状斑块，斑块边缘有褐色晕纹，随着病情的发展，病斑扩

3、大汇合成云纹状或不规则形状大病斑，包围整个叶鞘，最后叶鞘腐败继而叶子枯黄；病斑向上扩展危害果穗时，荀叶也可见褐色云纹状病斑，玉米籽粒灌装不足，批粒增多，粒重下降，玉米好粒，穗轴容易变褐腐烂，影响玉米的产量和品质；危害莲杆时，形成不规则褐色病斑，后期莲杆质地松软，组织开始解体，纤维素暴露，玉米容易倒伏（唐海涛等，2004)。当空气干燥时，病斑中间呈灰白色，边缘暗褐色；当高温多雨时，病斑会长出稠密的白色菌丝体，菌丝体集结形成黑褐色大小不一不规则颗粒状的菌核，菌核在29-33°C时最易形成，菌核容易脱离寄主，遗落田间（宋佐衡等，1993;张培坤

4、等，2001)。1.2玉米遗传转化方法根癌农杆菌介导的遗传转化是植物基因工程众多遗传转化方法中研究得最清楚、应用最成功的一种，在已获得的200多种转基因植物中约80%是由该方法完成(王关林和方宏綺，1998)。有关农杆菌介导玉米遗传转化的报导始于1987年，Grimsley等（1987)以幼苗分生组织为外植体，将玉米条纹病毒（MaizeStreakVims)的cDNA成功导入其中，部分叶片出现了病毒感染的症状。Shen和Hohn(1994)采用农杆菌介导法将报告基因导入玉米自交系中，在胚芽鞘和幼叶中检测到基因的表达。Gould等（1991)用农杆

5、菌法转化玉米莲尖，获得了转基因玉米，并且首次证明外源基因已整合到玉米基因组巾并遗传到Ti代。Ishida等（1996)将超双元载体pSB131、pTOK233转化A188及其杂交种的幼胚，转化效率达到5%?30%，其后学者用超双元载体分别转化A188和Hill也得到了类似的结果（Negrottoetal.,2000;Zhaoetal.，1998;Zhaoetal.，1999;Zhaoetal.，1999)。Frame等（2002)将载体pTF102转化Hill的幼胚，平均转化效率达到了5.5%，To、Ti、T2代植株分子检测表明基因和基因都整合到

6、玉米基因组中并稳定表达。Sidorov等（2006)釆用农杆菌介导法转化I型愈伤组织，效率达到2%-10%BIA3301(质粒图谱见图1)四川农业大学黄玉碧老师惠赠，质粒pUbi-bar(图谱见图2)由华巾农业大学孙东发老师惠赠.限制性内切酶、保真酶、去憐酸化酶、dNTP、反转录试剂盒、PMD19-T载体购自Takala公司，PCR纯化回收试剂盒、切胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自北京全式金生物技术有限公司，组培所用的MS培养基、N6培养基等购自PhytoTechnologyLaboratories公司，L-Cysteine、L-Proline

7、、MES等购自Sigma公司。2.1.4实验所用的引物及其作用.LB培养基（液体)：NaCl10g、蛋白膝10g、酵母浸粉5g，用2mol/L的NaOH调节pH至7.0，12rC灭菌20min,冷却至50°C左右时加入相应的抗生素。LB培养基（固体):NaCl10g、蛋白腺10g、酵母浸粉5g、琼脂15g，用2mol/L的NaOH调节pH至7.0,121°C灭菌20min，使用前加入相应的抗生素。愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代培养基（/L):N6盐4g、N6维生素ImL、1mg/mL2,4-D2mL、脯氨酸2.8g、庶糖30g、

8、水解酪蛋白100mg、肌醇lOOmg、植物凝胶4g,用1mol/L的KOH调节pH至5.8，121°C灭菌18min,冷却至5(