玫烟色拟青霉几丁质酶基因chit2和蛋白酶基因pr

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1、玫烟色拟青霉几丁质酶基因chit2和蛋白酶基因pr、文献综述1引言虫害是农作物和林作物的重要灾害，对农业经济和林业经济的发展造成严重阻碍。在很长的一段时间里，化学农药作为防治农业和林业害虫的重要手段被广泛应用，但是造成了严重不良后果，其中危害最大的后果：一是农药的残留给包括水体、大气和土壤在内的生态环境造成了极大污染，这些农残又进一步通过食物链进入人体,给人体健康造成极大危害；二是导致害虫严重抗药性的产生，这既降低了防治效率，又提高了防治成本。因此，既可规避上述缺点、又有效治理病虫害的重要措施生物防治无可争议地成为了行业内关注的热点⑴。在以虫治虫、以鸟治虫等生物

2、防治措施中，以菌治虫即微生物治虫成为了最重要的手段之一，其中，真菌杀虫剂又以其具有主动侵染、污染小、寄主不易产生抗性、有较宽的寄主范围可对付多种昆虫及可通过侵染角质层即感染寄主等独特优点，而成为微生物杀虫剂的首选。自1890年美国第1次使用白僵菌防治麦长蝽后，迄今，人类利用真菌防治害虫已有一百多年的历史，特别是20世纪60年代以来，真菌防治已经开始广泛投入生产应用。现在，用以防治害虫的真菌已扩展到了白僵菌、绿僵菌、黄僵菌、芽霉菌等，其中，白僵菌和绿僵菌是目前研究较多的真菌杀虫剂，拟青霉也成为了近年来研究的热点。然而，真菌杀虫剂也和其他微生物杀虫剂一样，存在对昆虫

3、的杀虫效率较低、致死时间较长、防效不稳定等问题，这严重限制了这一防治措施的规模应用。下面，.就真菌杀虫剂的相关背景进行一个简要综述。..2研究背景2.1昆虫病原真菌的侵染机制昆虫病原真菌的侵染过程可分成4个阶段：1)虫体附着孢的形成；2)孢子在虫体上萌发;.3)穿透寄主虫体的体壁；4)菌丝充盈虫体、分泌毒素，毒杀昆虫。昆虫病原真菌是否能成功侵染寄主取决于分生孢子是否能附着于寄主表皮并萌发。不同的昆虫病原真菌以不同的方式附着于寄主：有的孢子可通过自身的游动随水流吸附到寄主身上；有的分生孢子有弹性，能主动弹射到寄主体壁上；而有些毛管孢子则可用其尖端的粘液粘附到运动中

4、的昆虫上去；有些分生孢子则随气流或水流的流动与寄主被动相遇。从吸附形式上看，有特异性吸附和非特异性吸附两种，特异性吸附是主导形式，在孢子入侵昆虫体壁的过程中起主要作用；而非特异性吸附在长时间持续下可发生向特异性吸附的转化。此外，真菌分泌的表皮降解酶，如蛋白酶、几丁质酶和外源凝聚素等也有助于孢子的附着。附着在寄主表皮的分生抱子在合适的湿度和温度条件下可以萌发。影响孢子在寄主体壁上萌发的因素主要有三个：一是湿度，孢子萌发需要较高的湿度；二是适当的寄主，因为特异性寄主的体壁上存在有可以刺激孢子萌发的物质，因此只有在合适的昆虫体壁上，孢子才能有效萌发；三是分生孢子需要克

5、服昆虫体壁上具有的抑菌物质，如菌肽、脂肪酸等⑸。附着在昆虫体壁的人多数孢子在萌发时芽管顶端会分化成特殊的侵染结构，也就是附着胞、侵入钉、入侵丝和入侵盘等。附着胞是最先形成且具有重要作用的结构，它是芽管为附着在寄主表皮而在端部形成膨大体。附着胞上会朝着表皮长出尖细的穿透钉扎破昆虫表皮。表皮一旦被突破，穿透钉就会在表皮中继续延伸，并形成穿透菌丝，向血腔伸展；否则穿透结构将向两侧膨大，形成穿透板，或称穿透菌丝段。因此，附着胞的形成是昆虫病原真菌建立与寄主的致病关系的关键因素。..二、玫烟色拟青霉几丁质酶产量提高的条件优化和几丁质酶基因chit2的克隆、重组质粒构建及表

6、达1材料玫烟色拟青霉JZ-7菌株，采自江苏南京，寄主为烟粉虱，由江苏省农业科学院植物保护研究所虫害生防实验室分离得到并保存；表达载体PET-28a、PET-32a由实验室保存，PPICZB、GS115由浙江大学馈赠，BL21购自北京全式金生物科技有限公司。..2主要仪器及试剂2.1主要仪器实验仪器型号生产商台式恒温振荡器IS-RE>D3超低温保存箱青岛海尔股份有限公司冰箱青岛海尔股份有限公司电泳伩DYY-8C型北京市六一仪器厂微波炉凝胶成像仪冷冻台式高速离心机5417R德国Eppendorf公司水浴锅XMTD-8222精宏仪器厂PCR仪2720美国ABI公

7、司超净工作台ZHJH-C1106C上海智诚分析仪器制造有限公司核酸蛋白测定仪德国Eppendorf公司.2.2实验试剂蟹壳几丁质，D-葡萄糖，酵母浸出物，胰蛋白胨，N-乙酰氨基葡萄糖（NAG)琼脂，NaCl,MgS04，KH2PO4,粉状几丁质，锅牛酶，氨节青霉素，IPTG，X-gal等均购自上海生工生物有限公司。PCRmix,TaqDNA聚合酶购自东盛生物公司。PeasyTS载体，DH5a感受态细胞购自百斯凯科技有限公司。GenomeeScript?1stStrandcDNASynthesisKit,LATaq酶购自Takara公司。375'-RACE

8、试剂盒为Clontech