褐飞虱几丁质降解酶系基因家族分析

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1、褐飞虱几丁质降解酶系基因家族分析第一章前言1.1几丁质与壳聚糖几丁质(Chitin)是一种由P-1,4-糖苷键连接7V-乙酸弄D-葡糖胺(GlcNAc)构成的线性多聚糖。1811年法国植物学家Braconnot在蘑错中首次发现并分离得到。1823年法国科学家Odier发现几丁质是生物外壳的组成成分之一，并命名为Chitin,源自希腊文信封一词，也有外壳的意思(HudsonandJenkins2002)。几丁质在自然界中的含量丰富，仅次于纤维素，广泛存在于真菌、线虫、蓬类、节肢动物及某些软体动物、腔肠动物中。在自然界中的几丁质存在三种晶体

2、结构，?-，yS-和7-几丁质。几丁质为生物体中的主要存在形式，也是最稳定的形式，而后两者在生物体中存在极少，仅在枪乌贼的内部支撑羽状结构(骨路)、胃袋内层及桂藻的棘状突起中有报道(ChavanandDeshpande2013)。在大多数生物体中，几丁质与其他高分子聚合物(如葡聚糖、蛋白质等)结合而形成各种结构。而在一些环纹桂藻中，会产生由高度乙酰化且没有与其他聚合物结合的纯几丁质形成的放射状棘状突起，是目前自然界中存在的纯度最高的几丁质形式(Patiletal.2000)。在几个真菌类群中几丁质能够代替纤维素作为结抅多糖构成其细胞壁结

3、构。在昆虫中，几丁质是构成外骨體的重要成分，同时也存在于许多昆虫的内部结构中，如气管内壁、中肠围食膜等组织，另外在一些昆虫的唾液腺、口器、前肠、后肠及肌肉附着点也有几丁质的存在(KramerandMuthukrishnan2005)。几丁质与糖蛋白结合形成几丁-蛋白复合体，形成坚硬的外骨潘，维持昆虫的特定形态，支撑昆虫柔软的内部结构，保护昆虫免受外界的机械损伤及病原侵染。由于表皮的坚固性限制了昆虫的生长，它会被周期性地降解以达到昆虫生长发育的需求。昆虫在不同发育阶段其几丁质含量也随之变化，Kramer等人报道在烟草天蛾(Mam/eret

4、al.1995)。在骨化前新蛹的表皮几丁质仅含有2%,而在骨化后含量剧增10倍多(KramerandMuthukrishnan2005)。.1.2几丁质代谢途径在生物体中，几丁质在几丁质合成酶和降解酶的共同作用下维持动态平衡。昆虫几丁质的生物合成途後由血琳巴中含量较高的海蓬糖的分解开始用的酶是几丁质合成酶(MerzendorferandZimoch2003)(图1-2)。第二章常用仪器、试剩与方法2.1常用仪器及主要试剂PCR仪，Bio-Red凝胶成像仪Gene-GeniusBio-Red实时荧光定量仪，Bio-Red显微注射仪Femt

5、ojet，Eppendorf微量移液器，Eppendorf台式冷冻离心机(Centrifoge5415R型)，Eppendorf超纯水仪，MILIPORENanoDrop2000,ThermoScientific恒温培养摇床，ThermoForma隔热恒温培养箱(9050型)，上海一恒科技有限公司-80°C冰箱，SANYO4°C,-20°C冰箱，Sumsung2.2常规实验方法1)-8°C保存的菌种复苏后均匀涂布于无抗性的LB平板上，37°C恒温培养箱培养10-12h;2)LB平板上挑取活化的单菌

6、落，接种于3mlLB液体培养基中，37°C恒温摇床200rpm培养过夜；3)取上述培养液1ml按照1:100的比例接入100mlLB液体培养基中，37°C200rpm摇菌2-3h，直至ODsoo值达到0.4-0.6之间；4)培养液置冰上冷却l0min，分装到无菌50ml离心管中并平衡，4°C，4000rpm离心5min,弃上清；5)每管加入26.7ml预冷的CaCl2(0.1M)，轻微震荡混匀，悬浮细胞，冰上放置30min;6)4°C,4000rpm离心5min，弃上清；7)每管加入6.7ml预冷的CaC

7、l2(0.1M)，充分混句，冰上放置2h;8)每管加入80%甘油1.34ml作为冷冻保护刻(终浓度15-20%)，混匀后管进行分装，可立即用于转化实验或-8°C超低温冷冻保存备用。第三章褐飞虱几丁质酶的基因分析及生物学功能..........153.1实验材料.........163.2实验方法.........173.3结果与分析.........223.4总结与讨论.........41第四章褐飞虱y5-7V-乙酰己糖胺酶的基因分析及生物学功能.........434.1实验材料.........434.2实验方法.....

8、....444.3结果与分析.........474.4总结与讨论.........57第五章褐飞虱几丁质脱乙酰酶的基因分析及生物学功能.........595.1实验材料.........605.2实验方