中低温度热疗诱导骨肉瘤细胞株凋亡论文

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1、中低温度热疗诱导骨肉瘤细胞株凋亡论文单乐群，裘秀春，马保安，周勇，王育才，张殿忠，范清宇【Abstract】AIM:Toobservetheapoptosisoftheosteosaracells(OS9901)inducedbyhyperthermiaandtoexplorethepossiblemechanismformildtemperaturetreatmentofosteosara.METHODS:TheosteosaraOS9901cellsperaturesfor1h.Thecellapoptosisicroscope,TUNELstainingandcounting.T

2、heBcl2proteinexpressionintheOS9901cellsia(43℃,1h)usingtheimmunohistochemicaltechnology.RESULTS:Agreatnumberofabnormalosteosaracellsentfor1h.Transmissionelectronmicroscopydemonstratedtypicalapoptosismorphologicalfeaturesofthecells,includingsizereduction,chromatincondensation,andapoptoticbodiesapp

3、earance.Thehighestapoptosisratereached42%analyzedbyTUNELstaining.Theimmunohistochemistryshoententfor1hinducesapoptosisofosteosaracells.HyperthermiadecreasestheBcl2proteinexpressionintheosteosaracells,soastoinducetheapoptosisofthecells.Thisstudyprovidessometheoreticalbasisforthemechanismunderlying

4、theapoptosisoftumorcellsinducesbythermotherapy.【Keyia,induced;osteosara;apoptosis;ultrastructure;immunohistochemistry【摘要】目的：研究加热诱导成骨肉瘤细胞株(OS9901)凋亡，为中低温度热疗辅助成骨肉瘤综合治疗提供理论依据.方法：成骨肉瘤OS9901细胞株分别经不同温度的热疗作用1h.freel公司.bcl2多克隆抗体购自美国SantaCruz生物技术公司.免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒均购自华美公司.电子显微镜为日本GEM2000EX公司产品.1.2方法1

5、.2.1细胞培养骨肉瘤OS9901细胞株常规以单层细胞贴壁培养于含100g/L小牛血清的RPMI1640培养液中（含青霉素1×105U/L，链霉素100mg/L，以0.6mol/L碳酸氢钠溶液调PH值至7.0左右），置于37℃，CO2恒温孵育箱，3d传代1次.1.2.2分组根据细胞株在不同温度条件加热1h，分别设置40℃，43℃，46℃和37℃对照组，细胞经加热处理后，用Hank氏液洗涤2遍，再用RPMI1640培养液洗涤1遍后继续放置37℃，CO2恒温孵育箱培养6h.1.2.3加热方法将处于对数生长期的OS9901细胞株消化后分装入离心管，恒温条件采用电热恒温水浴箱加热（温度波动＜±

6、0.1℃），将盛有细胞悬液的离心管置于水浴箱中加温(距液面4cm处).为保证温度准确并去除升温时差,将温度计置于含相同体积培养液的离心管内,于同一水平面测温,当达到指定温度时开始记时,加温时间为1h.1.2.4透射电镜检查分别取不同温度组的细胞悬液离心后弃去上清，加入4℃预冷2g/L的戊二醛4mL，4℃固定30min，送电镜室脱水包埋后制成超薄切片，透射电镜下观察照相.1.2.5TUNEL法检测细胞凋亡按照TdTFragELTM.DNAFragmentationDetectionkit说明进行操作.1.2.6计数TUNEL阳性凋亡细胞百分率单盲法手工计数20个不同视野（400倍显微镜）下

7、TUNEL阳性细胞及正常细胞，计算凋亡细胞百分率.1.2.7免疫组织化学染色不同取样时间取出细胞悬液进行甩片，950mL/L乙醇乙醚等量固定液固定至少15min，用SABC试剂盒进行bcl2染色，过程按照试剂盒说明操作，设立空白对照.无阳性反应细胞且背景同空白对照者为阴性(-)，标本阳性细胞率低于30％为(+)，标本阳性细胞率介于30％~60%之间者为()，标本阳性细胞率高于60％为().2结果2.1形态学观察骨肉