切割穹隆海马伞后大鼠海马中83 ku差异蛋白的质谱分析

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1、切割穹隆海马伞后大鼠海马中83ku差异蛋白的质谱分析朱蕙霞，秦建兵，金国华，田美玲，张新化，黄镇【摘要】　　目的：探讨切割穹隆海马伞海马中具有诱导神经干细胞向神经元分化生物活性的83ku差异蛋白的组成成分及其功能。方法：切割SD大鼠穹隆海马伞后14d海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(NativePAGE)，应用电喷雾质谱分析、蛋白质数据库和文献分析等方法对83ku差异蛋白进行检测和功能分析。结果：质谱分析找到了17组肽段，这些蛋白按照其功能可以分为：细胞骨架蛋白、参与代谢的酶、信号传递、蛋白降解、氧化应激、神经递质运输、突触形成、功能未知蛋白。结论：切割穹隆海马

2、伞海马83ku差异蛋白可以通过参与Rho信号通路，调控神经干细胞向神经元分化。【关键词】83ku蛋白；切割穹隆海马伞；海马；非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；质谱分析　　〔Abstract〕Objective:Toexploretheingredientsandfunctionsoftheactive83kuproteinsinducingNSCstodifferentiateintoneuronsfromthefimbria/fornixtransectedhippocampus.Methods：TheSpragueDapionthe14thdayafterfimb

3、ria/fornixtransectionassspectrometry，proteindatabankandbibliometricsetryanalysisof83kuproteinfound17groupsofpeptideseinmetabolism，signaltransduction，proteindegradation，oxidativestress，neurotransmittertransport，synapseformationandunknobria/fornixtransectedhippocampusmayregulatethediff

4、erentiationofNSCsintoneuronsviaRhopathbria/fornixtransection；hippocampus；NativePAGE；massspectrometryanalysis　　神经干细胞的发现为中枢神经损伤、退行性疾病以及脑肿瘤等的治疗提供了新思路，但其临床应用还要解决如何诱导神经干细胞迁移及分化等问题。我们近期的研究〔1，2〕观察到，移植至切割穹隆海马伞侧海马齿状回中迁移的神经干细胞密度明显大于正常侧海马中迁移的密度，在切割侧移植的神经干细胞更易于向神经元分化；在体外细胞培养中，切割穹隆海马伞的海马提取液也比正常海马

5、提取液更能促进神经干细胞向神经元和AChE阳性神经元分化〔3〕。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(NativePAGE)83ku蛋白胶条与神经干细胞共培养，证实该差异蛋白能够诱导神经干细胞向神经元分化，在此基础上〔4〕，本研究进一步应用质谱分析探讨83ku差异蛋白的组成成分及其功能。　　1材料和方法　　1.1切割大鼠穹隆海马伞　　取220～250g成年SD大鼠10只（南通大学实验动物中心提供），参照Paxinos图谱确定双侧穹隆海马伞的切割范围，按文献〔2〕方法进行双侧穹隆海马伞切割，然后按性别分笼饲养。　　1.2NativePAGE　　术后14d取双侧海马组织制成匀

6、浆，进行蛋白定量，然后将蛋白质浓度稀释调整为3μg／μl后分装，冻存于-70℃冰箱中备用。按文献〔5〕方法进行NativePAGE电泳，选取部分胶条进行考马斯亮蓝染色、脱色。　　1.3电喷雾质谱分析（electrosprayionizationmassspectrometry，ESIMS）　　根据染色、脱色后凝胶显示的83ku差异蛋白条带位置，切取切割穹隆海马伞后14d海马组织蛋白胶条〔6〕，用胰蛋白酶水解20h后，放入美国Finnigan公司生产的LCQDECAXPplus质谱仪中进行ESIMS分析，采用微量电喷雾的进样方式，毛细管温度为170℃，柱面积

7、为0.15mm×0.15mm(RPC18)，正离子检测。　　利用Finnigan公司系统中的SEQUEST检索程序，检索IPIHUMAN数据库（人类蛋白质组，HUPO提供）。检索条件设置为：当电荷为＋１时，Ｘcorr≥1.9；当电荷为＋2时，Ｘcorr≥2.2；当电荷为＋3时，Ｘcorr≥3.75；同时设定匹配肽段间ΔＣｎ≥0.1，蛋氨酸可变修饰16.00。　　1.4蛋白功能分析　　质谱分析检索后得到的蛋白质输入PubMed（.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=searchDB=PubMed）进行蛋白质功能文献分析

8、。　　2结果　　通过电喷