Salsolinol合成酶的克隆表达及其生物功能的研究

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1、Salsolinol合成酶的克隆表达及其生物功能的研究冯程程2015年1月中图分类号：UDC分类号：Salsolinol合成酶的克隆表达及其生物功能的研究作者姓名冯程程学院名称生命学院指导教师邓玉林教授答辩委员会主席费也淳教授申请学位理学硕士学科专业生物学学位授予单位北京理工大学论文答辩日期2015年1月22日Molecularcloning,expressionandbiologicalfunctionofSalsolinolSynthaseCandidateName：ChengchengFengScho

2、olorDepartment:SchooloflifescienceFacultyMentor:Prof.YulinDengChair,ThesisCommittee：Prof.YechunFeiDegreeApplied:MasterMajor：BiologyDegreeby:BeijingInstituteofTechnologyTheDateofDefence：January22，2015研究成果声明本人郑重声明：所提交的学位论文是我本人在指导教师的指导下进行的研究工作获得的研究成果。尽我所知，文中除

3、特别标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京理工大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的合作者对此研究工作所做的任何贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。特此申明。签名：日期：北京理工大学硕士学位论文摘要帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）是一种常见于中老年人的中枢神经系统退行性疾病，研究发现生物体内存在一类由多巴胺（Dopamine，DA）衍生而来的MPTP结构类似物——儿茶酚异喹啉类物质(CAIQs)。Sal

4、solinol（6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉，Sal）作为一种能在人脑和尿液中检测到的内源性儿茶酚异喹啉类物质，在一定条件下，它及其衍生物能引起多巴胺能神经元的死亡从而参与PD致病过程。Sal合成酶（Salsolinolsynthase）是儿茶酚异喹啉类物质合成代谢过程中的首个关键酶，它是一种催化多巴胺和乙醛生成多巴胺能神经毒性物质Salsolinol的酶，直接影响到Sal及其衍生物在体内的代谢过程。研究证实Sal合成酶存在于鼠脑中，通过对纯化的Sal合成酶进行氨基酸序列分析获得其氨基酸序列。

5、研究发现Sal合成酶氨基酸序列与泛素有94.8%的相似性，由此可通对泛素基因定点突变获取Sal合成酶基因。本文采用PCR技术扩增Sal合成酶基因，将其连接到原核载体pET28a和真核表达载体pcDNA4上，获得重组质粒，并将其转化到大肠杆菌BL21和真核HEK细胞中。Sal合成酶基因在细菌和细胞内大量表达，SDS-PAGE电泳结果及Western-blot显示出分子量约为12KD特异性蛋白质条带，与Salsolinol合成酶蛋白分子量大小一致。经亲和层析分离得到纯化的Salsolinol合成酶蛋白。通过三重

6、四级杆串联质谱检测Sal合成酶的催化活性，结果表明过量表达的Sal合成酶体现出较高的活性，证明前期获得的蛋白基因所表达的蛋白具有Sal合成酶活性。关键词：帕金森病Salsolinol合成酶克隆和表达纯化酶活I北京理工大学硕士学位论文AbstractParkinson’sdisease(PD)isachronicprogressiveneurodegenerativedisorder.Therehavebeenincreasingevidencesindicatingtheendogenousdopamine

7、-derivedcatecholisoquinolineswhosestructureissimilarwithMPTP,maybeapossiblecandidateofdopaminergicneurotoxinstoelicitPD.Salsolinol(6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline,Sal)asonekindofendogenouscatecholisoquinoline,itcanbedetectedinhumanbrainanduri

8、ne.Salsolinolsynthaseisoneofthemostimportantenzymesinvolvedintheformationofcatecholisoquinolineneurotoxin.Itisanovelenzymewhichcancondensatedopamineandacetaldehydetosalsolinol,andcausesthedeathofdopaminergicn