洋甘菊eβf合成酶基因的克隆及功能研究

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1、分类号：单位代码：10364密级：学号：12720390安徽农业大学学位论文洋甘菊EβF合成酶基因的克隆及功能研究Cloningandcharacterizationof(E)-β-farnesenesynthasefromMatricariarecutitaL.研究生：苏闪闪指导教师：袁艺教授申请学位门类级别：理学硕士专业名称：植物学研究方向：药用植物的开发与利用所在学院：生命科学学院答辩委员会主席：2015年6月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进巧的研究了作及取得的研究成果。尽我所知．除了义中特别加化标巧和致谢的地方外

2、，论义中不包含巧他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构一的学位或证书術使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均ｄ在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研巧半豁對时问：＞少年／月／州关于论文使用授权的说明本人完令了解安徵农业大学有关保留，：学校有权、使用学化论文的规定即＾，、保留送交论义的巧印件和磁盘，允许论义被查阅和借阅可斗采用影印缩印或？＾、汇编学位论文１心用不同方式巧不同扫描等复制子段保存。同意安徽农业大学可媒体上发表。、传播学位论文的全部或部分内奔（保密的

3、学位论文在解密后应遵守此愤议）＇研化牛／〇．宿名时间；Ｗ年口ｆ＾３＾。Ｊ时间１广；％年占月口第导师签名；如（摘要洋甘菊(MatricariarecutitaL.)为菊科母菊属一年生草本植物，含有丰富的倍半萜和类黄酮等化合物，具有良好的抗炎、抑菌、抗氧化、降血脂、抗凝血、抗肿瘤、解痉等功效。(E)-β-法尼烯（EβF）是一种普遍存在于植物内的挥发性倍半萜类物质，作为蚜虫报警信息素的主要成分，参与蚜虫的防御化学信号传递。为了阐明EβF生物合成的代谢调控，本研究一方面克隆了洋甘菊(E)-β-法尼烯合酶基因，并研究了该基因的功能；

4、另一方面利用GC-MS技术检测茉莉酸甲酯处理后洋甘菊叶片中挥发性萜类含量的变化。该研究初步探讨了茉莉酸甲酯调节洋甘菊萜类次生代谢的规律，为通过基因工程手段提高洋甘菊倍半萜含量提供了理论基础。该研究取得的主要结果如下：1.利用RT-PCR及RACE技术克隆了洋甘菊βFS基因的全长cDNA序列，命名为Mr-βFS。该基因全长为2010bp，包含一个1725bp的开放阅读框，编码579个氨基酸(GenBank序列号:KM586847)。推测氨基酸分子量为67kDa，等电点为5.28。洋甘菊βFS的氨基酸序列与青蒿的βFS有较高同源性，同源性为92%，而与

5、其他植物同源性约为20%-40%。进化树分析结果表明，Mr-βFS与青蒿亲缘关系最近。2.构建了原核表达质粒pET-28a-βFS，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了重组蛋白，重组蛋白分子量大小为67kDa。将目的蛋白与底物法尼基焦磷酸(FPP)进行反应，通过GC-MS检测，表明Mr-βFS催化底物生成唯一的倍半萜成分为(E)-β-法尼烯。3.利用荧光定量PCR检测Mr-βFS基因在不同器官中的表达量。结果表明，Mr-βFS基因在茎、叶、管状花、舌状花中均有表达，在叶中表达量最高，管状花中表达量最低，叶中表达量约是管状花中表达量的6.8倍。Mr

6、-ΒFS基因在洋甘菊花的全开期表达量最低，在花苞期及半开期的表达量分别是全开期的1.6倍和2.6倍。4.利用外源茉莉酸甲酯(MeJA)对洋甘菊叶片进行处理后，Mr-βFS表达量明显增加。其中，在处理24h后Mr-βFS表达水平增加最为显著，是对照组的11.5倍。GC-MS分析表明，MeJA诱导后叶片中几种挥发性萜类β-罗勒烯、(E)-β-法尼烯、大根香叶烯D、γ-榄香烯、α-法尼烯的含量与对照相比均存在显著差异(P<0.05)。关键词：洋甘菊，EβF合成酶，克隆与表达，茉莉酸甲酯IAbstractMatricariarecutita(L.)isak

7、indofannualherbfromGenusMatricariainAsteraceae,whichcontainsabundantchemicalcompoundssuchassesquiterpenesandflavonoids,andthereforehassignificantantiinflammatory,antibacterial,anti-oxidation,hypolipidemic,anticoagulation,antineoplasticandspasmolyticproperties.(E)-β-farnesene(E

8、βF)isanimportantsesquiterpenecompoundwidelyexistsinanumberofp