利迪链霉菌ⅰ型聚酮合成酶基因克隆及功能的研究

《利迪链霉菌ⅰ型聚酮合成酶基因克隆及功能的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中文摘要为了研究I型聚酮合成酶特别是硫酯酶在链霉菌中acyltetramicacid类抗生素合成中的作用，以利迪链霉菌为例，改进PCR方法，运用基因阻断技术和LC／MS分析方法，试图从分子水平研究I型聚酮合成酶中的酮酰基合成酶、硫酯酶以及抗生素合成基因簇中的修饰酶S．腺苷蛋氨酸合成酶和细胞色素P450在利迪链菌素生物合成中的作用。运用FTIR技术测定发酵培养后的菌体，红外数据用PCA、HCA和ANN分析，试图找到利迪链霉菌开始合成利迪链菌素时的biomarker，以及用于突变株高通量筛选的方法。获得如下主要结果：针对链霉菌基因

2、组DNA高GC含量的特点，改进了PCR体系。用改进的PCR体系克隆得到了硫酯酶II、3．氧酰基．ACP合成酶II、S．腺苷蛋氨酸合成酶以及细胞色素P450的基因片段，并确定3．氧酰基．ACP合成酶II、硫酯酶II和s．腺苷蛋氨酸合成酶参与了利迪链菌素的生物合成，而扩增得到细胞色素P450对利迪链菌素的合成没有直接影响。同时发现，链霉菌中aeyltetramicacid类抗生素利迪链菌素的生物合成需要硫酯酶，不同于目前在真菌中发现的2种同类抗生素equisetin和fusarinC的生物合成。发酵培养基中添加L．蛋氨酸，L．赖氨

3、酸，L．精氨酸、L．异亮氨酸和L．色氨酸，引起菌体细胞内s．腺苷蛋氨酸含量的下降，导致利迪链菌素含量的下降，其中以蛋氨酸和精氨酸的效果最为显著。s．腺苷蛋氨酸可以提高利迪链菌素的产量，表明L一蛋氨酸不是利迪链菌素生物合成的直接前体，而主要是通过合成s．腺苷蛋氨酸，提供利迪链菌素结构中的N．甲摹。H202通过诱导蛋白的表达，改变了菌体的正常代谢途径，降低了利迪链菌素的产量并积累了其他物质。运用FTIR技术结合PCA、HCA，很好地区分了处于不同发酵时间的利迪链霉菌AS4．2501，并找到了利迪链霉菌合成利迪链菌素时可能的生物标志

4、物(biomarkers)；尝试用FTIR技术结合ANN较好地预测了具有不同利迪链菌素合成能力的利迪链霉菌的突变株。表明基于代谢物组分析的FTIR技术与ANN的结合，有望用于菌株诱变后的高通量筛选。关键词：利迪链菌素；I型聚酮合成酶；LC／MS；利迪链霉菌AS4．2501：Biomarkcr；高通量筛选ABSTRACTInordertodeterminetheroleofPKSlinthebiosynthesisofacyltetramicacidantibiotic，GenefragmentsofthioesteraseII

5、，3-oxaeyl-ACPsynthase11，S-adenosylmethioninesynthetaseandcytochromeP450ofStreptomyceslydicusAS4．2501wereamplifiedbyPCR．ThefunctionoftheSegenesinstreptolydiginbiosynthesiswereevaluatedafterthemetabolitesofdisruptionmutantstrainsofthesegeneswereanalyzedbyLC／MS．Foresti

6、matingthebiomarkerofStreptomyceslydicusforproducingstreptolydiginandthemethodforhigh-throughputscreeningthemutantstrain。FTIRwasusedtodetectthemycelium，whichwerecalculatedfordifferenttime,andthedatawereanalyzedbyPCA．HCAandANN．Theobtainedresultsareasfollows：AstheGCcon

7、tentofi扭genomicDNAismorethan70‰theUOrmaIPCRmethodisnotsuitableforStreptomyces，andthePCRsystemforStreptomyceslydicusAS4．2501wasoptimized．GenefragmentsofthioesteraseII，3-oxacyl—ACPsynthaseII，S—adenosylmethioninesynthetaseandcytochromeP450ofStreptomyceslydicusAS4．2501w

8、cl"efirstlyclonedbytheoptimizedPCRinourlaboratory．Functionsofthesegenesweredeterminedafterthefermentationproductsofthesegenesmutantstrains