油菜长链脂酰coa合成酶基因的克隆与功能鉴定

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1、江苏大学硕士学位论文摘要在油料作物中，种子油脂是对人类最具有经济价值的生活必需品和工业原料，提高种子油脂含量也就是提升油料作物的生产效益。本文主要通过克隆长链酰基辅酶A合成酶基因并鉴定其在油脂合成途径中的生物学功能，从而期望通过基因工程手段提高油料作物种子含油量。长链酰基辅酶A合成酶(LACS)把游离脂肪酸活化成为长链酰基辅酶A，从而在脂肪酸的合成与分解代谢中起着重要作用。这类重要的酶参与若干种与脂肪酸相关的代谢，如脂肪酸链的活化和延伸，磷脂、甘油三酯、茉莉酸的生物合成等。最近我们实验室从油菜油脂合成旺盛部位(花和发育期的种子)分离出四

2、个长链脂酰辅酶A合成酶基因(BnLACSl、BnLACS2、BnLACS3和BnLACS4)。生物信息学分析显示这四个长链脂酰辅酶A合成酶(BnLACSs)氨基酸序列都具有三个Block，初步被认为属于LACS家族。分子进化树分析显示，BnLACSl与拟南芥AtLACSl具有较高的同源性，BnLACS2和BnLACS3与拟南芥AtLACS2具有较高的同源性，AtLACSI$1AtLACS2定位于内质网上，在植物角质主要成分长链脂肪酸的合成中起着重要作用。BnLACS4与定位于叶绿体的AtLACS9有较高的同源性。通过酵母LACS缺陷型补

3、救实验，进一步证明四个BnLACSs都具有LACS活性。油菜BnLACSs蛋白都偏好利用长链脂肪酸。在水解蛋白酶缺陷型酵母p卅中异源表达，结果显示BnLACSl和BnI。ACS2能够使宿主酵母的脂肪酸和油脂含量显著提高。以上在酵母真核表达系统中的结果初步确定BnLACSl和BnLACS2参与油脂合成，并且能够使酵母油脂含量提高。江苏大学硕士学位论文利用RT．PCR技术分别分析了召，以CSj，BnLACS2、BnLACS3衫BnLACS4在不同含油量油菜品系种子(35DAP)中的表达差异，结果显示在高含油量品系中这些基因表达更为强烈。研究

4、这四个基因在高含油量油菜(50％)和低含油量油菜(30％)两个油菜品系的种子发育时期的表达丰度动态变化，结果显示BnLACSI并[IBnLACS2表达量变化趋势与种子发育期油脂合成速率的S型曲线趋势一致，并且结果还进一步验证BnLACSl和BnLACS2表达量在高含油量油菜品系种子明显高于低含油量油菜品系种子。以上结果显示BnLACSs，尤其是BnIACSl和BnLACS2在油菜种子的油脂合成途径中起着重要作用。为了鉴定油菜BnLACSs的生物学功能，我们还构建了各个基因的双元植物表达载体，载体中利用在种子中特异表达的Napin启动子，

5、然后通过农杆菌介导转化拟南芥和甘蓝型油菜。目前已经得到曰，必傩j和BnLACS4的拟南芥转化株系，并通过筛选得到转基因纯系。通过浸花法和抗生素筛选法得到油菜转化株系，利用近红外和核磁共振技术初步分析显示：BnLACSl油菜转基因植株的种子含油量提高约5％。关键词：甘蓝型油菜，长链脂酰CoA合成酶，RT-PCR，荧光定量PCR，含油量，2D．TLC，GC—MSHInoilcrops，theoil(i．e．triacylglycerols)isthemostvaluableproductoftheseeds．Enhancingthequan

6、tityofoilperweightbasisinoilcropswouldincreasethevalueofthecrop．Aspartofourefforttoidentifyenzymesthatiscriticalforproducinglargeamountsofplantoilintheseedofoilcrops·Long．chainacyl．coenzymeAsynthetases(LACSs)activatefreefattyacidtoacyl．CoAthioestersandplayanimportantrole

7、infattyacidanabolismandcatabolism．Theseclassesofimportantenzymesareinvolvedinseveralfattyacid．derivedmetabolicpathways，suchastheactivationandelongationoffattyacids，biosynthesisofphospholipids，triacylglycerolandjasmonate·Inthisstudy,fourcDNAsencodedlongchainfattyacyl-CoAs

8、ynthetasehavebeenisolatedfromrapeseed(Brassicanapus)flowerorseeds，designatedasBnLACSl，BnLACS2，BnI么CS3an