红盖鳞毛蕨查尔酮合成酶基因的克隆与功能分析

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1、学校代码：10270分类号：Q946学号：112200887上骖脚范夫墨硕士学位论文论文题目红盖鳞毛蕨查尔酮合成酶基因的学专克隆与功能分析院生命与环境科学学院业植物学研究方向蕨类植物学研究生姓名谢颖华指导教师王全喜教授曹建国教授完成日期2014年4月硕士学位论文红盖鳞毛蕨查尔酮合成酶基因的克隆与功能分析上海师范大学生命与环境科学学院二零一四年四月MasterDissertationThechalconesynthasegenecloningandfi‘analys"‘Drvopte"士unctlonanalySISinDryopt

2、erzseryt。n’rosoraCollegeofLifeandEnvironmentSciencesShanghaiNormalUniversityApril2014论文题目：红盖鳞毛蕨查尔酮合成酶基因的克隆与功能分析学科专业：植物学学位申请人：谢颖华指导教师：王全喜曹建国摘要红盖鳞毛蕨(Dtyopteriserythrosora(Eaton)O．Ktze)是药用蕨类植物，含有丰富的黄酮类化合物，具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌消炎等功能。目前对于红盖鳞毛蕨黄酮类化合物的研究集中在含量的测定和种类分析上，对于影响黄酮含量和形成的内外因

3、素尚无系统的研究。在自然条件下，季节变化对黄酮含量有明显的影响，然而此方面的研究尚无报道。有关蕨类植物中黄酮类化合物生物合成途径已经起步，目前已经在蕨类中克隆到查尔酮合成酶(chalconesynthase，CHS)基因，但仍没有对其功能的分析。基于以上的背景，本研究获得以下两方面的结果。1．对红盖鳞毛蕨的羽片、叶轴、根和茎(根茎)的总黄酮含量和抗氧化活性进行季节动态分析。红盖鳞毛蕨各部位总黄酮含量均表现出明显的季节动态变化。羽片中平均黄酮含量只有2．01％，最低含量为0．78％，而茎中黄酮含量为4．3％．12．5％，明显高于羽片

4、中黄酮含量。在春季，茎中黄酮含量相对较低，但是在夏季含量迅速增加，在秋季和冬季都具有较高的含量。而羽片中黄酮含量变化则表现相反的规律，在春季羽片黄酮含量升高但是到夏季后黄酮含量明显下降，随后含量一直处于较低的水平。因此，茎和羽片中的黄酮含量在季节变化上表现出明显的负相关关系。羽片、叶轴、根和茎的黄酮类化合物提取液的抗氧化活性也随着不同采集时间、不同含量而表现不同的清除能力。一般而言，茎的黄酮类化合物提取液抗氧化能力最强，可以选取茎作为药用部位。2．对红盖鳞毛蕨的查尔酮合成酶进行基因的克隆与功能分析。以孢子体中提取的RNA、DNA为

5、模板，通过PCR技术获得红盖鳞毛蕨的查尔酮合成酶基因ORF序列和基因组序列。生物信息学分析表明，该基因ORF区为1212bp，编码403个氨基酸，含有一个内含子并且遵循寸／ag剪切规则。BLAST序列比对发现本实验所获得CHS基因与其它物种的该基因序列具有较高的同源性，构建进化树进行同源性分析，表明红盖鳞毛蕨CHS基因与渐尖毛蕨、槐叶萍、水蕨等蕨类的CHS基因亲缘关系更近。蛋白序列比对表明红盖鳞毛蕨CHS蛋白具有Cysl70，His314，Asn347等CHS活性位点和G383FGPG信号序列。将CHS目的片段与PET32a载体连

6、接构建原核表达载体转化到大肠杆菌BL21中，使用IPTG诱导蛋白表达，进行SDS．PAGE分析和Westernblotting验证，红盖鳞毛蕨CHS基因在大肠杆菌中得到表达，形成了一个大小为63KD的蛋白，与预期结果相符合。体外酶活实验验证了原核表达的红盖鳞毛蕨CHS蛋白具有活性，能催化底物生成柚皮素。综上所述，红盖鳞毛蕨各部分总黄酮含量呈现明显的季节动态变化，春季羽片中黄酮含量较高，可采集羽片加以利用，其它季节茎中黄酮含量较高，可采集茎使用。CHS是红盖鳞毛蕨黄酮类化合物生物合成途径中的关键酶，功能分析表明原核表达的红盖鳞毛蕨C

7、HS蛋白具有活性。本研究为蕨类植物黄酮类化合物生物合成途径的研究奠定了基础，对揭示蕨类植物中黄酮类化合物合成的调控机制也具有重要意义。关键词：查尔酮合成酶；红盖鳞毛蕨；黄酮类化合物；PCRThesistopic：ThechalconesynthasegenecloningandfunctionanalysisinDO，opteriserythrosoraProfessionaldisciplines：BotanyDegreeapplicant：XieYinghuaInstruction：WangQuanxiCaoJianguoAb

8、stractDryopteriserythrosoraisatraditionalmedicinalfem，whichisrichinbioactiveflavonoids，ithavetheeffectofantiviral，antineopla