花生(arachis hypogaea l.)蔗糖合成酶基因ahsusy的克隆及功能分析

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1、河北农业大学硕士学位论文花生（ArachishypogaeaL.）蔗糖合成酶基因AhSuSy的克隆及功能分析姓名：何美敬申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：刘立峰20120525IIlllIIIIr[1lPillIllllIIIIl[IIIlUIY2143532摘要干旱是影响植物生长发育的重要环境因子。揭示干旱胁迫下植物体内的基因表达调控机制对于阐明植物的应答反应及培育耐旱品种具有重要的理论和现实意义。蔗糖合成酶(SucroseSynthase，SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶，在植物生长、发育和渗透调节过程起着重要的作用。本研究利用同源克隆

2、、RACE和TAIL．PCR相结合的方法从花生叶片中分离蔗糖合成酶基因AhSuSy，并对其表达特性及功能进行初步分析，旨在为改善花生耐旱性提供理论依据，主要研究结果如下：1．AhSuSy基因的克隆及序列分析：以拟南齐(AtSuSy序列为探针，通过同源克隆法及RACE技术，从窄叶花生品种中克隆得到了彳^勋Sy(基因登陆号JF346233)，AhSuSy的cDNA序列全长2，790bp，包含一个长为2421bp的开放阅读框。花生SuSy蛋白长度为806个氨基酸残基，分子量约92402．8Da，等电点约为6．31。序列分析表明，AhSuSy编码的氨基酸与大豆、

3、拟南芥等植物中相关蛋白的氨基酸序列同源性达75％以上，系统发育树发现与大豆的亲缘关系最近。2．AhSuSy基因组序列的克隆和序列分析：以花生基因组DNA为模板，利用染色体步移技术(GenomeWalking)中的嗍I广PCR技术扩iYdAhSuSy基因组序列和启动子区域，得到基因组序YlJ6189bp。启动子预测分析表明，该序列包含约825bpl黼动子上游调控序列，13个外显子，12个内含子。启动子元件分析显示该片段含有典型的TATA-box、CAAT—box，并存在低温响应元件LTR、GA响应元件P—box、干旱响应MYB结合位点MBS、厌氧诱导必要的

4、顺式作用元件ARE等调控元件及光响应元件G．box、box4等，说BL4hSuSy的表达可能受低温、干旱、缺氧、光照等环境因素以及激素GA的调控。3．AhSuSy基因原核表达载体的构建和表达：成功构建-了pET32a-AhSuSy原核表达载体，在IPTG诱导下得至tJ92KD左右的目的蛋白，与理论值相同。4．AhSuSy基因的表达特性分析：花生苗期半定量RT-PCR分析表明正常条件下AhSuSy在花生根、茎、叶中均有表达。其中，在根中的表达丰度最高。利用10％PEG模拟干旱处理花生幼苗，结果表明胁迫后AhSuSy的转录表达量、蔗糖合成酶活性和蔗糖含量均在

5、4h．12h逐渐升高，12h．24h逐渐降低，推测该基因能够响应干旱胁迫，在花生抗旱调控中起着一定的作用。关键词：花生；蔗糖合成酶；干旱胁迫；基因克隆；功能分析MolecularCloningandFunctionalAnalysisonSucroseSynthaseGeneAhSuSyfrom。PeanutCandidate：HeMeijingMajor：CropGeneticsandBreedingSupervisor：Prof．LiuLifengDroughtstressisthemajorenvironmentalaffectingfactori

6、nthegrowthanddevelopmentofplant．Studiesonthemechanismofplantgeneexpressionandregulationhaveanimportantacademicandrealisticsignificantonclarifyingthedroughtresponseofplantanddrought—tolerantbreeding．Sucrosesynthase(SuSy)，whichisanexclusivenecessaryenzymeinthepathwayofsucrosemetabo

7、lism，playsanimportantroleinplantgrowth，developmentandosmoticadjustmentprocess．Inthisstudy,AhSuSywasisolatedbyhomologouscloningcombinedwithRACEandTAIL-PCRmethodfrompeanut．The彳^．鼬syexpressionpatternwascharacterizedanditsfunctionwasfurtherresearched．Theresultsprovidedtheoreticalfoun

8、dationfordroughttoleranceimprovementofpe