急性缺血再灌注大鼠脑中γ氨基丁酸a型受体α1mrna的表达变化论文

《急性缺血再灌注大鼠脑中γ氨基丁酸a型受体α1mrna的表达变化论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、急性缺血再灌注大鼠脑中γ氨基丁酸A型受体α1mRNA的表达变化论文张俊清王伟薛钢孙智敏【摘要】目的观察大鼠脑组织中GABAARα1mRNA在脑缺血再灌注不同时段的表达及动态变化规律，探讨其在脑缺血再灌注损伤中的意义。方法55只健康雄性CAO)模型，至上述规定时间点后取大脑组织，利用地高辛标记寡聚核苷酸探针原位杂交技术与计算机分析系统在光学显微镜下观察GABAARα1mRNA分别在相应海马区及大脑皮质阳性神经元的表达情况，以及相应海马区及大脑皮质的病理变化。结果假手术组GABAARα1mRNA表达同正常对照组相比没有明显改

2、变。而各手术组GABAARα1mRNA表达在脑缺血2h再灌注24h开始下降，3d下降显著.freelRNA在急性脑缺血再灌注时含量降低可能为脑缺血再灌注损伤的重要原因。【关键词】脑缺血再灌注;γ氨基丁酸A型受体α1mRNA;原位杂交【Abstract】ObjectiveToobservetheexpressionofGABAARα1mRNAandthedynamicregulationinthebrainofratsinfocalcerebralischemiareperfusion,andinvestigatethes

3、ignificanceinischemiareperfusioninjury.MethodsFiftyfivemaleCAO模型，采用原位杂交技术对大鼠脑组织中GABAARα1mRNA进行检测，来观察γ氨基丁酸A型受体基因在脑缺血再灌注损伤中的动态变化规律及其作用机制。1材料与方法1.1研究对象健康CAO)，大鼠用10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉，取仰卧位固定于鼠台，碘伏消毒后颈部正中切口，暴露右颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉近心端，血管夹夹闭颈内动脉，在近颈总动脉分叉处留置一

4、条结扎线以便插线后固定鱼线，在颈总动脉近分叉处剪一约0.3mm小口，将头部蘸有石蜡的鱼线(线直径0.26mm，长50mm)经小口处插入，沿颈内动脉入颅，进线深度由分叉处算约20mm，稍感阻力时停止，此时已至大脑中动脉起始处，以活结结扎用于固定鱼线的结扎线，缝合手术切口，缺血2h后将线栓抽出，松开颈总动脉上的活结造成缺血再灌注模型,假手术对照组除不插鱼线外，其余步骤同缺血组。1.2.2标本取材和石蜡切片制作：分别在上述规定时间点，给予大鼠10%的水合氯醛0.5ml腹腔注射麻醉，剪开胸腔经左心室快速输入0.9%氯化钠注射液，同

5、时剪开右心耳，待血色变淡后快速输入4%多聚甲醛磷酸缓冲液(含有1/1000DEPC)固定脑组织，待鼠颈及四肢僵硬后，停止灌注，快速断头取脑置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液(含有1/1000DEPC)固定保存。取视交叉前后约4mm厚脑组织经常规脱水、浸蜡、包埋。石蜡切片连续冠状切片，42℃温水展开，片厚6μm，将石蜡切片贴于涂有多聚赖氨酸的切片上，置于60℃烤箱内过夜，放4℃冰箱待用。1.2.3原位杂交过程：①石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O21份+蒸馏水10份混合,室温10min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。②暴露mRNA核

6、酸片段：切片上滴加1ml3%柠檬酸，100ul新鲜稀释的胃蛋白酶混匀，37℃或室温消化10min，原位杂交用PBS洗5min×3次，蒸馏水洗涤3次。③预杂交：干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20ul加预杂交液。恒温箱42℃4h。吸取多余液体，不洗。④杂交：按每张切片20ul杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱42℃杂交过夜。⑤杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温2×SSC洗涤5min×2次;37℃0.5×SSC洗涤15min×1次;37℃0.2×SSC洗涤15

7、min×1次。⑥滴加封闭液：37℃30min。甩去多余液体，不洗。⑦滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃60min，原位杂交用PBS洗5min×4次。⑧滴加SABC：37℃20min，原位杂交用PBS洗5min×3次。⑨滴加生物素化过氧化物酶：37℃20min，原位杂交用PBS洗5min×4次。DAB显色：使用DAB显色试剂盒，1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本上。显色20min，充分水洗。苏木素复染，充分水洗。酒精脱水，二甲苯透明，封片PBS洗3次×5min。蒸馏水洗1次。1.2.4观察项目和统计学处理：在4

8、00倍显微镜视野下计数各组脑组织海马区及大脑皮层GABAARα1mRNA阳性神经元数及观察GABAARα1mRNA分别在相应海马区及大脑皮质阳性神经元表达的改变。采用江苏捷达科技公司的形态分析系统进行图像分析，每张切片随机选取10个高倍视野，测量原位杂交的阳性神经元数目。采用SPSS13.0软件进行统计